酵母线粒体β-酮酰-ACP还原酶的结构生物学研究

摘要

脂肪酸是自然界中极为重要的一类疏水性分子，在细胞内扮演着多种多样的角色。细菌、植物和动物细胞内都拥有各自的脂肪酸合成体系，负责以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为原料的从头合成。有两种类型的合成酶系统，Ⅰ型脂肪酸合成酶存在于脊椎动物、酵母细胞质基质以及一些细菌中，该酶只含一条或者两条庞大的多个结构域的多功能肽链。Ⅱ型脂肪酸合成酶存在于植物和大多数细菌中，是由不同基因编码多种不同的酶参与整个合成反应。近年来，研究发现在酿酒酵母线粒体中存在着Ⅱ型脂肪酸合酶。而针对该条合成代谢中各个反应来说，共计有六种基因参与编码这些酶，分别是ACP1，CEM1，MCT1，HTD2，ETR1和OAR1。其中OAR1基因负责编码线粒体β-酮酰-ACP还原酶(YmtOAR1)，研究表明删除酵母细胞中的该基因直接导致呼吸缺陷型表型及生长的抑制。此外，线粒体中的脂肪酸合成体系被证明与tRNA的加工过程息息相关。
　　 YmtOAR1属于SDR(short-chain alcohol dehydrogenase)蛋白家族，与其他物种的同源蛋白(FabG)存在20％-30％的同源性。但不同的是，一级序列中的插入序列及C-末端的缺失，导致了整体结构并没有呈现经典的Rossmann折叠花样，在溶液中呈现独特的二聚体聚合状态。YmtOAR1以辅酶NADPH作为负氢供体，通过质子传递，催化底物还原。本论文的研究工作解析了2.6(A)分辨率的apo-YmtOAR1晶体结构以及两套含有辅酶NADPH复合物的晶体结构。结构分析表明，YmtOAR1与所有已报道的同源蛋白有着明显的结构差异;且这种差异也从一定角度阐明了聚集状态与同源蛋白不同的原因。同时，YmtOAR1在结合辅酶后的构象发生了较为显著的变化，并且两套含配体的复合物晶体结构显示NADPH的构象亦略有不同。三套晶体结构可以用来模拟辅酶进入酶活口袋的动态过程。此外，在结构分析的基础上，通过定点突变和酶活性检测，确定了辅酶识别的关键残基Arg14，该残基对于辅酶识别酶是极其重要的，该残基的突变直接导致酶活性的丧失和极大地降低了酶对辅因子的亲和力。对于YmtOAR1的结构解析无疑拓展了我们对SDR家族蛋白丰富性的进一步认识，同时对更深入理解酶促反应机制提供了结构基础。
　　 真核生物的内膜系统极为发达，不但区分了各种生化反应所发生的场所，也提供了各种细胞器之间的物质交流模式——囊泡运输。转运囊泡包裹货物分子，在一些特殊蛋白的辅助下，与特定的靶膜融合，从而完成对货物分子的筛选和运输。在SNARE和Sorting Nexins这两种蛋白家族的协助下，囊泡经过出芽或融合，后经分拣和运输，抵达靶位点。
　　 存在于酿酒酵母细胞高尔基体到晚期溶酶体分拣途径中的重要蛋白Mvp1，是一个较为特殊的Sorting Nexins蛋白。MVP1基因与VPS1基因存在一定的联系性，过量表达Mvp1蛋白可抑制VPS1的几个等位基因。关于Mvp1蛋白参与囊泡分拣过程的机制目前还未阐明。本项研究结晶了Mvp1蛋白部分片段（⊿N117-Mvp1），尝试解析晶体结构，但由于衍射分辨率较低，故相应的优化工作仍在进行之中。

目录

声明

摘要

第一篇 酿酒酵母线粒体β-酮酰-ACP还原酶(YmtOAR1)结构与功能研究

第1章 绪论(研究背景综述)

1．1．1 脂肪酸合成体系概述

1．1．2 Ⅰ型脂肪酸合成酶体系：庞大的多酶复合体

1．1．3 Ⅱ型脂肪酸合成酶体系：独立分散的单功能酶合成体系

1．1．4 线粒体中的脂肪酸合成体系

1．1．5 线粒体脂肪酸合成途径与tRNA加工

1．1．6 酵母线粒体脂肪酸合成途径的研究进展

第2章 实验材料与结果

1．2．1 酵母线粒体β-酮酰-ACP还原酶(YmtOAR1)重组表达及其突变体载体的构建

1．2．2 YmtOAR1重组蛋白及其突变体的表达纯化

1．2．3 YmtOAR1蛋白结晶及与辅酶NADPH共晶条件的筛选与优化

1．2．4 YmtOAR1蛋白晶体和YmtOAR1-NADPH复合物晶体X-射线衍射数据收集

1．2．5 晶体衍射数据处理

1．2．6 衍射数据的相位确定，结构解析和模型修正

1．2．7 晶体结构模型质量验证

1．2．8 YmtOAR1及其突变体与辅酶NADPH结合实验

1．2．9 YmtOAR1及其突变体的酶活测定

1．2．10 YmtOAR1及其突变体的圆二色光谱测定

第3章 YmtOAR1晶体结构分析与讨论

1．3．1 YmtOAR1的拓扑结构

1．3．2 YmtOAR1的三级结构和空间构象

1．3．3 与同源蛋白的比较

1．3．4 YmtOAR1的辅酶结合口袋与活性位点

1．3．5 YmtOAR1基于辅酶结合所引起的构象变化

1．3．6 保守的催化机制-质子传递链和负氢转移

1．3．7 辅酶识别机制-关键性残基的探究

1．3．8 YmtOAR1的四级结构：独特的同二聚体

1．3．9 YmtOAR1与酰基载脂蛋白(ACP)的作用方式

本章小结

第4章 实验材料、设备及方法补充

1．4．1 实验材料与设备

1．4．2 实验方法补充

参考文献

第二篇 酿酒酵母囊泡转运相关蛋白Mvp1结晶学研究

第1章 绪论(研究背景综述)

2．1．1 真核生物细胞膜间的交流-囊泡转运

2．1．2 囊泡形成的过程

2．1．3 SNARE蛋白家族参与膜融合过程

2．1．4 Sorting nexins(分拣蛋白)参与胞内囊泡转运分选途径

第2章 实验方法、结果与讨论

2．2．1 酵母囊泡转运蛋白Mvp1的质粒构建、表达与纯化

2．2．2 酵母囊泡转运蛋白Mvp1的结晶

2．2．3 Mvp1蛋白晶体的衍射情况

本章小结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果