结核分枝杆菌Pup蛋白的结构特性研究以及布氏锥虫SUMO、Nedd8系统的细胞功能研究

摘要

随着原核生物和古细菌中类泛素蛋白修饰系统的发现以及对真核生物类泛素修饰系统的研究，人们认识到这种蛋白质修饰系统存在的广泛性及重要性。本论文中，我们研究了结核分枝杆菌中类泛素蛋白Pup的结构及其分子作用机制、布氏锥虫中SUMO修饰系统以及布氏锥虫中Nedd8修饰系统在布氏锥虫细胞中的功能。本论文将分为三个部分来陈述我们所得到的实验结论。
　　 本文研究的一方面就是原核生物结核分枝杆菌类泛素蛋白Pup的结构与其分子作用机制。真核生物中，尽管类泛素蛋白之间的氨基酸序列保守性很低，但是类泛素蛋白都具有类似的泛素样空间结构。有趣的是，我们的研究发现结核分枝杆菌类泛素蛋白Pup除了与真核生物的类泛素蛋白序列相似性很低外，Pup蛋白还具有与真核生物类泛素蛋白完全不一样的结构特征。我们通过各种生物信息学手段分析预测Pup蛋白的结构特性，并辅以CD检测、SPR实验以及核磁共振实验证实了Pup蛋白是天然无结构蛋白。进一步的SPR实验和核磁共振实验揭示了Pup蛋白的碳末端能与蛋白酶体调节亚基Mpa作用，从而部分揭示了Pup介导蛋白降解的机制。
　　 本论文的主要研究是围绕布氏锥虫中SUMO修饰系统和Nedd8修饰系统在布氏锥虫细胞中的功能而展开的。布氏锥虫是一种单细胞寄生真核生物，其类泛素蛋白修饰系统的研究还是空白。因此通过细胞生化实验，我们首先确定了SUMO系统和Nedd8系统在布氏锥虫中是存在的，进而发现SUMO系统和Nedd8系统所参与的细胞生物学进程有很大不同。布氏锥虫中的SUMO系统在细胞有丝分裂期姐妹染色单体分离过程中具有重要作用，并且是维持布氏锥虫基因组稳定所必须的。此外，我们鉴定了出了参与SUMO修饰的E1，E2酶，并且构建了布氏锥虫的体外SUMO化实验体系以便开展后续的研究工作。而布氏锥虫Nedd8修饰系统在调节布氏锥虫体内蛋白泛素化水平方面、DNA复制执照发放方面以及鞭毛贴附方面具有重要作用。这也是首次报道Nedd8系统具有调节布氏锥虫鞭毛贴附的功能。后续对布氏锥虫SUMO系统和Nedd8系统的深入研究将有助于揭示其调节各种生物进程的分子机制。

目录

声明

摘要

第1章 类泛素蛋白功能的研究进展

1．1 引言

1．2 真核生物类泛素蛋白的种类及修饰过程

1．2．1 真核生物泛素化的发现及研究现状

1．2．2 真核生物中类泛素蛋白的种类及修饰过程

1．3 古细菌类泛素蛋白及其修饰过程

1．4 原核生物类泛素蛋白Pup及其修饰过程

1．5 SUMO蛋白参与的细胞生物学进程及与疾病发生的相关性

1．5．1 SUMO蛋白参与姐妹染色单体分离的机制

1．5．2 SUMO蛋白参与DNA修复的机制

1．5．3 SUMO蛋白与疾病

1．6 Nedd8蛋白参与的细胞生物学进程及与疾病的相关性

1．6．1 Nedd8蛋白与蛋白质降解

1．6．2 Nedd8蛋白与基因转录调节和DNA复制执照的发放

1．6．3 Nedd8蛋白与疾病

1．7 布氏锥虫中的类泛素蛋白及研究价值

1．7．1 布氏锥虫中的类泛素蛋白

1．7．2 研究布氏锥虫类泛素蛋白的意义及价值

第2章 原核生物类泛素蛋白Pup的结构和功能研究

2．1 原核生物类泛素蛋白Pup研究背景介绍

2．2 研究结果与讨论

2．2．1 蛋白序列分析、圆二色光谱实验以及核磁共振实验结果揭示Pup的无序性

2．2．2 表面等离子体共振实验及核磁共振实验验证Pup蛋白与蛋白酶体调节亚基Mpa的结合

2．2．3 pup可能通过识别Mpa介导其修饰蛋白被20S蛋白酶体降解

2．3 实验材料及方法

2．3．1 序列分析与进化树分析

2．3．2 Pup蛋白与Mpa蛋白纯化

2．3．3 圆二色光谱(CD)检测

2．3．4 表面等离子体共振实验检测

2．3．5 核磁共振实验

2．4 总结

第3章 布氏锥虫中SUMO蛋白在细胞周期中的调节功能

3．1 SUMO蛋白研究背景介绍

3．2 布氏锥虫细胞周期

3．3 实验材料与方法

3．3．1 细胞培养与转化

3．3．2 实时定量反转录PCR

3．3．3 流式细胞术分析

3．3．4 核型统计

3．3．5 免疫荧光

3．3．6 BrdU掺入实验

3．3．7 体外SUMO化实验

3．3．8 免疫印迹实验

3．4 研究结果与讨论

3．4．1 从基因组中鉴定SUMO蛋白

3．4．2 在前循环形式细胞中干扰SUMO蛋白表达

3．4．3 SUMO敲除对细胞周期的影响

3．4．4 SUMO敲除导致细胞出现异常核型

3．4．5 SUMO敲除不影响S期的DNA合成

3．4．6 SUMO敲除不影响纺锤体形成

3．4．7 SUMO蛋白前体的成熟化

3．4．8 SUMO蛋白的定位

3．4．9 参与布氏锥虫SUMO化的酶

3．5 总结

第4章 布氏锥虫中Nedd8蛋白在细胞周期中的调节功能

4．1 Nedd8系统研究背景介绍

4．2 实验材料与方法

4．2．1 细胞培养与转化

4．2．2 免疫荧光

4．2．3 核型统计

4．2．4 流式细胞数分析

4．2．5 实时定量反转录PCR

4．2．6 免疫印迹实验

4．2．7 酵母双杂交

4．2．8 BrdU掺入实验

4．2．9 串联亲和纯化

4．2．10 提取细胞骨架

4．3 研究结果与讨论

4．3．1 鉴定可能的Nedd8蛋白

4．3．2 在前循环形式的布氏锥虫中干扰Nedd8的表达

4．3．3 Nedd8敲除对细胞周期的影响

4．3．4 Nedd8敲除细胞的核型分析

4．3．5 敲除Nedd8蛋白引起泛素化水平下降

4．3．6 Nedd8修饰系统中的酶

4．3．7 Nedd8敲除引起细胞重新开始DNA合成

4．3．8 Nedd8敲除影响纺锤体形成

4．3．9 Nedd8蛋白定位

4．3．10 Nedd8与鞭毛贴附区(FAZ)的关系

4．3．11 Nedd8的底物

4．4 总结

第5章 总结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果