托吡酯对偏头痛模型大鼠三叉神经节中A2AR的影响

摘要

目的:通过对硝酸甘油偏头痛模型大鼠使用偏头痛的预防药物托吡酯(topiramate，TPM)、氟桂利嗪(flunarizine，FNZ)干预后，留取大鼠三叉神经节组织，检测各组大鼠三叉神经节中腺苷2A受体(adenosine2Areceptor,A2AR)蛋白的表达量及降钙素基因相关肽(calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)的含量变化。证实托吡酯可能通过抑制A2AR表达减少CGRP的释放从而预防偏头痛的发作，也为托吡酯预防性治疗偏头痛的作用机制提供新的实验和理论依据。　　方法:　　1.分组:选取月龄为3-4个月及体重180-200g的清洁级健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，按照随机数字表法，随机将所有SD大鼠分为4组，每组10只，依次分为:空白组、模型组、托吡酯组（以下简称TPM组）、氟桂利嗪组（以下简称FNZ组）。　　2.造模:在空白组大鼠颈背部皮下注入生理盐水(NS)10ml/kg，其余3组则依照Tassorelli法在大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)10mg(2ml)/kg，按上述方法每周1次，共5周，每次注射完毕后对各组大鼠进行行为学评分。　　3.药物干预:从第2周开始，每天1次按时对各组大鼠予以灌胃:空白组NS10ml/kg/d、模型组NS10ml/kg/d、FNZ组氟桂利嗪1.25mg/Kg/d、TPM组托吡酯9mg/kg/d。　　4.取材:第5周各组大鼠注射药物、灌胃4小时后，腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，待大鼠完全麻醉后剖胸，心脏灌注，断头、开颅、分离脑组织及硬脑膜，暴露颅底三叉神经节，摄取中间完整部分（约2-3cm）用4％多聚甲醛固定，部分保存于4℃冰箱（用于HE染色、免疫组化），部分保存于液氮中(用于western-blot)。　　5.检测:①取各组部分三叉神经节组织行HE染色，显微镜下观察组织结构变化;②免疫组织化学（SP法）检测CGRP在各组偏头痛大鼠三叉神经节中含量变化;③免疫荧光法检测A2AR蛋白在三叉神经节组织神经元中的表达情况;④Western-blot法检测A2AR蛋白表达量的变化。　　6.对检测结果应用SPSS17.0软件行统计学分析。　　结果:　　1.注射硝酸甘油后各组大鼠行为学评分:模型组与空白组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);两种药物干预组（即FNZ组和TPM组）分别与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);两药物干预组间相互比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　2.HE染色显示:各组镜下观察三叉神经节结构基本一致，无显著差异。　　3.免疫组化法检测CGRP的含量:测其OD值显示CGRP在各组三叉神经组织中的表达差异有统计学意义(P＜0.01)，其中模型组明显高于空白组，FNZ组高于空白组和TPM组但低于模型组，TPM组高于空白组且低于模型组和FNZ组。　　4.免疫荧光双重染色检测A2AR的表达:在三叉神经节组织中A2AR蛋白主要表达于神经元细胞，各组三叉神经节上表达A2AR的阳性神经元细胞数差异有统计学意义(P＜0.01);其中TPM组的荧光强度和阳性细胞数均明显低于模型组及FNZ组，与空白组相近。　　5.Western-blot检测A2AR的蛋白表达量:测其灰度值显示A2AR在各组中的表达差异有统计学意义(P＜0.01)，其中空白组和TPM组的A2AR蛋白表达量均明显低于模型组和FNZ组。　　6.模型组中CGRP的OD值与A2AR灰度值行相关分析的结果显示差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论:　　1.硝酸甘油偏头痛模型大鼠三叉神经组织无解剖结构上的改变，提示大鼠行为学改变可能是功能性的异常。　　2.A2AR的激活或蛋白上调和CGRP的大量释放可能参与了偏头痛的发生机制，且两者的变化趋势一致。　　3.经典偏头痛预防治疗用药氟桂利嗪可能通过抑制三叉神经感觉纤维末梢CGRP的释放来达到预防治疗偏头痛的效果，但对A2AR蛋白表达无影响。　　4.托吡酯可能通过抑制A2AR的激活或下调其蛋白表达继而抑制CGRP的释放达到预防偏头痛发作及减轻偏头痛症状的效果。　　5.托吡酯对偏头痛的疗效还可能优于氟桂利嗪。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要试剂

3 实验技术路线及预期目标

4 实验方法

5 检测方法

6．统计学处理

结果

1 大鼠行为学评分及结果分析

2 三叉神经节组织HE染色结果

3 三叉神经组织中CGRP含量免疫组织化学测定(SP法)结果

4 三叉神经组织中A2AR表达Western-blot蛋白定量测定结果

5 三叉神经组织中A2AR表达蛋白免疫荧光测定结果

6 模型组大鼠行为学评分与A2AR灰度值相关性分析

7．模型组CGRP的OD值与A2AR灰度值相关性分析

讨论

1．偏头痛的发作特点及发病机制

2．CGRP、A2AR与偏头痛的关系

3．氟桂利嗪对CGRP、A2AR的作用

4．托吡酯对CGRP、A2AR的作用

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述 亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对偏头痛的影响

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