基于网络药理学分析蒙药蓝盆花保肝的作用机制及物质基础

摘要

目的：传统蒙医的临床实践证明,蒙药蓝盆花具有保肝的药理作用,但由于其药效活性成分及作用机制尚不明确,因此,对蒙药蓝盆花的单体化合物进行保肝的体外活性筛选,并应用网络药理学的分析方法通过"多成分、多靶点、多途径"预测蒙药蓝盆花中活性成分的保肝作用靶点,同时应用PCR技术及分子对接对部分活性成分的保肝靶点进行验证,以初步探讨蒙药蓝盆花中保肝的活性成分及其作用机制.　　方法：①采用MTT法检测蒙药蓝盆花中37种单体化合物对人正常肝细胞HL-7702生长的影响.建立H2O2诱导HL-7702细胞氧化损伤模型,观察以上37种单体对人正常肝细胞氧化损伤的保护作用.②利用中国知网和Pubmed搜索蒙药蓝盆花的所有化学成分,通过Swiss和Superpred数据库建立蒙药蓝盆花的化合物靶点库.由于H2O2和CCl4都是导致细胞氧化损伤的经典诱导剂,故通过文献查阅,找到由于CCl4诱导氧化损伤所引起的所有上调、下调基因来建立CCl4诱导氧化损伤靶点库.搜寻OMIM数据库、Drugbank数据库和中国药典中与肝病及其治疗药物有关的靶点来建立疾病和治疗药物靶点库,并将化合物靶点库与上述三种靶点库进行比对,并利用Cytoscape建立相应的关联网络模型,通过DAVID在线数据库对共靶的KEGG通路进行分析,以此预测蒙药蓝盆花的保肝作用靶点.③应用荧光定量PCR和分子对接技术,验证蒙药蓝盆花中部分保肝活性成分的作用靶点,通过PCR法观察活性成分对肝脏基因表达量的影响.　　结果：①细胞毒结果：蒙药蓝盆花中对人正常肝细胞生长有抑制作用的化合物多数为有机酸,其中,原儿茶酸抑制作用最为显著,且剂量越高抑制作用越强.在苯丙素类成分里,咖啡酸(37)、咖啡酸甲酯(36)、异绿原酸C(4,5-二咖啡酰奎宁酸)(10)以及1,5-二咖啡酰奎宁酸(9)有明显的促增殖作用.单体抗氧化活性结果：细胞生长抑制率达50%时的H2O2的浓度和时间分别为281.5μmol/L、4h.和模型组比,保肝活性位居首位的是绿原酸(22)、异绿原酸A(24)和1,5-二咖啡酰奎宁酸(9)等苯丙素类化合物.黄酮类中的槲皮素(19)和木犀草素(28)均有较好的抗氧化活性,且剂量越高抗氧化活性越好.肝细胞损伤程度检测结果：通过细胞毒和活性筛选出的15种单体化合物,通过检测AST、ALT、MDA、SOD和GSH-Px生化指标发现,均在不同指标水平表现出了对H2O2诱导的氧化损伤肝细胞的保护作用,其中,芳香酸类成分原儿茶酸(1)和香豆素类成分秦皮乙素(16)效果最好.②网络药理学分析作用机制结果：通过将化合物靶点库与CCl4氧化损伤模型库、疾病靶点库、治疗药物靶点库进行比对,分析相应共靶和通路得知,STAT1、PPARG、HSP90AA1很可能是蒙药蓝盆花治疗肝病的主要靶点.③保肝靶点的验证部分：虽然前期经筛选得出原儿茶酸(1)和秦皮乙素(16)抗氧化效果最好,但由于原儿茶酸和秦皮乙素并不是蒙药蓝盆花的主要成分,因此并不将其作为最终筛选目标.qRT-PCR结果显示,通过筛选得出活性较好五种化合物-槲皮素(19)、木犀草素(28)、绿原酸(22)、咖啡酸(37)以及异绿原酸A(24)均在不同靶点水平上表现出了对肝细胞的保护作用.和模型组比,绿原酸(22)、咖啡酸(37)以及异绿原酸A(24)均上调了以上三种基因的表达.分子对接结果显示,绿原酸对接能量值数值相对较小,说明化合物可以与STAT1受体蛋白稳定结合并发挥作用.　　结论：①蒙药蓝盆花中的槲皮素(19)、木犀草素(28)和苯丙素类里的绿原酸(22)对H2O2诱导的肝脏细胞具有一定的保护作用.②蒙药蓝盆花保护肝脏的相关靶点为STAT1、PPARG、HSP90AA1.③PCR和分子对接结果证明,绿原酸很可能是蒙药蓝盆花治疗肝病的主要活性成分之一.

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