发育期小鼠给予叶酸对其成年期认知功能的影响及机制的研究

摘要

目的：研究发育期小鼠给予叶酸对其成年期认知功能的影响并探讨其影响机制.　　方法：2周龄小鼠腹腔给予不同剂量的叶酸(20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)直到12周龄,停药1周后通过Y迷宫实验、新奇事物识别实验研究发育期小鼠给予叶酸对其成年期行为学的影响,同时监测体重变化.待小鼠完成行为学测试后,用HE染色及尼式染色法,观察小鼠脑组织中海马的形态学变化;ELISA法测定各组小鼠海马中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine content,5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor-2、IGF2)蛋白的含量;RT-qPCR法检测海马中5-hmC、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、IGF2、DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase,Dnmt1)、DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferases3a,Dnmt3a)、DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferases3b,Dnmt3b)、甲基化-CpG-结构域结合蛋白1(Methyl-CpG-binding Domain protein1,MBD1)、甲基化-CpG结合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2,MeCP2)的mRNA水平变化;Western-Blot法检测海马中BDNF、Dnmt1、Dnmt3a、MBD1、MeCP2的蛋白表达水平.　　结果：与对照组相比,在Y迷宫实验中,叶酸中、高剂量组小鼠进入新异臂的次数明显减少(P＜0.05、P＜0.01),叶酸中、高剂量组小鼠进入新异臂的探索时间明显减少(P＜0.05、P＜0.01);在新奇事物识别实验中,叶酸中、高剂量组小鼠对新事物的识别能力较对照组相比明显下降(P＜0.05、P＜0.01);与对照组比较,从10周龄开始至停药后1周各剂量组小鼠体重明显减轻(P＜0.05);HE染色及尼式染色法结果显示,与对照组相比,叶酸高剂量组小鼠海马CA1区细胞排列松散、紊乱,尼氏小体丢失,表明海马神经细胞损伤;ELISA法结果显示,与对照组相比,长期给予叶酸后,叶酸组小鼠5-mC在海马部位中的表达程度均有所上升,其中叶酸中剂量组及叶酸高剂量组5-mC含量升高显著(P＞0.05),叶酸组小鼠5-hmC在海马部位中的表达程度均有所下降,其中叶酸中、高剂量组小鼠下降显著(P＜0.01),叶酸组小鼠IGF2含量显著低于对照组(P＜0.01);RT-qPCR结果显示,给予叶酸小鼠海马部位5-hmC和BDNF的mRNA水平较对照组减少,其中中剂量组与高剂量组有显著性差异(P＜0.01);叶酸高剂量组IGF2mRNA水平较对照组较少(P＜0.05);叶酸中剂量组、高剂量组小鼠在海马部位Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA水平对与照组比较均显著增加(P＜0.01);小鼠脑中海马部位MBD1和MeCP2mRNA水平较对照组增加,且高剂量组小鼠MBD1和MeCP2mRNA水平增加显著(P＜0.01);Western blot结果显示,与对照组比较,长期给予叶酸后小鼠海马部位Dnmt1和Dnmt3a表达水平增加,且叶酸高剂量组小鼠Dnmt1和Dnmt3a蛋白表达水平具有统计学差异(P＜0.01);叶酸高剂量组小鼠脑中海马部位MeCP2和MBD1表达水平显著增加(P＜0.01);叶酸高剂量组小鼠海马部位的BDNF含量较对照组减少(P＜0.05).　　结论：发育期小鼠长期给予叶酸引起其成年期认知功能障碍,其机制可能是通过改变5-mC、5-hmC、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、MBD1、MeCP2等基因的mRNA及蛋白表达水平,从而改变DNA甲基化模式及DNA甲基化动态平衡,影响BDNF、IGF2等基因的表达,导致神经发育异常,从而引起认知功能障碍.

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