泛素连接酶RNF168RING结构域的结构和功能研究

摘要

DNA双链断裂损伤（DNA double-strand break—DSB）是最为严重的DNA损伤。在人体中，DNA双链损伤如果得不到及时修复就会引发基因组的不稳定性，并诱发诸如癌症、免疫缺陷等重大疾病。为了消除DNA双链损伤可能对基因组完整性造成的恶性影响，细胞演化出复杂的分子机制中止细胞周期前行并启动DNA损伤修复以应对基因毒性压力。细胞内DNA双链损伤修复通路的信号传导开始于γH2AX依赖的信号级联放大，而终止于DNA损伤调节蛋白和修复蛋白在损伤位点的募集。根据早前报道，DNA双链损伤信号通过一系列翻译后修饰系统进行传导和放大，最近的一些研究又进一步强调了由泛素连接酶RNF8和RNF168催化的非降解性泛素链在此通路中的作用。
　　RING型锌指蛋白RNF8通过N端的FHA结构域识别并结合磷酸化的MDC1，从而定位到DNA双链损伤位点;通过C端的RING结构域与泛素结合酶(E2)Ubc13相互作用，催化H2A型组蛋白的泛素化，并在此基础上募集RIDDLE综合征蛋白RNF168。在目前关于RNF168的作用机制模型中，RNF168与泛素结合酶Ubc13相互作用，延伸在组蛋白H2A上经RNF8起始的泛素链，开启下游效应蛋白的募集，如肿瘤坏死因子BRCA1和53BP1。研究还发现，在DNA双链损伤位点形成的Lys63连接的泛素链主要来源于RNF168的催化作用。虽然最近的一些相关研究指出了RNF8/RNF168依赖的泛素信号放大通路中存在的一些负调控因子，但是RNF168-Ubc13复合体调控泛素信号放大的分子机制仍不明确，尤其是RNF8/RNF168与Ubc13之间相互识别的分子机理仍有待于进一步研究。
　　为了详细阐述RNF168的功能，我们解析了RNF168的RING结构域(1-111氨基酸残基)结构。我们发现RNF168的RING结构域核心区域的构象与经典的RING型锌指结构域的整体结构相似，都由一个中心α螺旋，两个反平行的β折叠以及两个长的loop组成，依靠与两个锌离子的配位来稳定结构。然而，我们通过将RNF168的RING结构域结构与TRAF6-Ubc13、CHIP-Ubc13-MMS2、RNF8-Ubc13-MMS2的复合体结构进行对比，发现了在RNF168的RING结构域结构中存在一些构象变化可能阻碍了与Ubc13的稳定结合。此外，我们的体内外实验也表明RNF168与Ubc13不能形成稳定地相互作用，因此我们推测在DNA损伤信号通路中，RNF8和RNF168的RING结构域作用机制并不一致。
　　PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)作为DNA聚合酶的辅因子，以三聚体的方式环绕DNA，它通过募集相关效应蛋白到复制叉来协调众多与基因复制相关的细胞过程，以此确保基因组的稳定性。值得注意的是许多与PCNA结合的蛋白都与PCNA的同一个表面相互作用，它们具有一个称为PIP-box的序列。泛素连接酶TRAIP也是一个RING型锌指蛋白，我们发现在它的C末端具有一段PIP-box序列，因此它可能是PCNA的一个潜在配体。MTH2虽然没有PIP-box序列，但是可以直接和PCNA相互作用，而且这种相互作用在PCNA被乙酰化修饰时将大为削弱。MTH2敲除还会缩短PCNA的半衰期，因此MTH2还具有稳定PCNA的作用。我们通过相关实验来验证PCNA与TRAIP，PCNA与MTH2的相互作用，为后续的实验打下基础。