尖吻蝮蛇中一种新的丝氨酸蛋白酶的纯化、性能及ACFⅡ降血压机理的研究

摘要

全文由两个部分组成。第一部分的研究内容:从尖吻蝮蛇粗毒中提取出一种新的纤维蛋白原溶解酶，并将其命名为DAnase，研究了DAnase提纯方法并对其相关理化性质进行了检测。第二部分的研究内容:研究了尖吻蝮蛇蛇毒中抗凝血因子Ⅱ(ACFⅡ)的降血压作用。文献报道静脉注射一定剂量的ACFⅡ能够引起大鼠血压降低，说明其具有降血压作用，但是ACFⅡ的降血压作用机理目前尚不清楚。在这部分中对ACFⅡ的降血压机理进行了研究。全文分为如下三章。
　　第一章:我们分别介绍了纤维蛋白（原）溶解酶、蛇毒金属蛋白酶、蛇毒丝氨酸蛋白酶、血液凝固过程、高血压、一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶(NOS)和ACFⅡ的相关知识。
　　第二章:通过阴阳离子交换层析的方法从尖吻蝮蛇蛇毒中提取出一种新的纤维蛋白原酶，并将其命名为DAnase。纤维蛋白原酶通常只有一条链，与其它纤溶酶不同，DAnase是一个由二硫键连接两条链的二聚体。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上DAnase的表观分子量为25 kDa，通过毛细管等点聚焦的方法检测出其等电点为6.03。DAnase具有纤维蛋白原酶活性，但不具有水解纤维蛋白的活性。它优先水解纤维蛋白原的Aα链，接着水解Bβ链，但对γ链没什么影响。DAnase也展示出了精氨酸酯酶活性，并且其水解纤维蛋白原能力和精氨酸酯酶活性都会被苯甲基磺酰氟(PMSF)和三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐(TCEP)抑制，但EDTA对其活性却没有任何影响，说明DAnase是一种丝氨酸蛋白酶，且其活性依赖于二硫键。DAnase强烈抑制ADP诱导的血小板聚集，但不具有水解ADP能力，说明DAnase对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用与其纤维蛋白原酶水解活性有关。DAnase不具有出血活性，也不具有活化凝血因子(ⅩⅢ)(F(ⅩⅢ))的能力。
　　第三章:通过阴阳离子交换层析的方法从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出ACFⅡ，ACFⅡ是一种凝血因子Ⅸ/Ⅹ结合蛋白，同时具有抗凝血作用和降血压作用。在本章中，我们研究了ACFⅡ对小鼠血清中一氧化氮含量的影响。结果表明，ACFⅡ会引起血清中NO含量增加，并且存在剂量依赖性。但是NO浓度会随着时间增加而逐渐减少，并最终稳定下来。ACFⅡ对血清中NO含量的影响作用会被一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、钙调蛋白抑制剂N-6（氨基己烷基）-5-氯-1-萘-磺胺(W-7)抑制，而心钠素抑制剂靛红(Isatin)对其没什么影响，表明ACFⅡ的降血压作用可能与一氧化氮合成酶或是钙调蛋白有关。为了进一步探索，我们从鼠脑中提取出钙调蛋白，但是ACFⅡ与钙调蛋白没有发生结合反应，表明钙调蛋白不是ACFⅡ的降血压作用靶点。虽然ACFⅡ的降血压作用靶点还未确定，但本文结果表明，ACFⅡ通过激活一氧化氮信号途径，产生降血压作用。ACFⅡ降血压作用靶点可能是一氧化氮合成酶或是位于NO信号传导途径中一氧化氮合成酶上游的蛋白质。