19F核磁共振探针用于体外和活细胞内弗林蛋白酶的活性检测

摘要

磁共振成像(MRI)广泛应用于医疗诊断，已经成为研究各种生理活动最有效的手段之一。然而，由于生物样本的背景中存在大量的水质子，1H MRI存在对比度-噪声比低的缺陷。对于特定目标的成像，19F的高灵敏度（83％相对于1H），100％自然丰度以及生物体内几乎为零的背景信号，使得19F MRI成为很有前景的方法。根据Itaru Hamachi等研究，含19F的分子组装成具有大分子量的聚集体时，其19F NMR波谱信号因横向弛豫严重变宽以致消失，并将此机制用于蛋白质和酶的检测。
　　弗林蛋白酶在体内平衡，阿尔茨海默氏病，炭疽病，埃博拉发热以及癌症中起着重要作用。许多种癌症都高表达弗林蛋白酶，包括非小细胞肺癌，头部和颈部的鳞状细胞癌等。因此，弗林酶的过表达为某些癌症的早期发展检测提供了依据。它能够识别剪切特定的氨基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg↓ X，其中Arg是精氨酸，Lys是赖氨酸，X可以是任意氨基酸，↓表示酶切位点。
　　本课题设计了基于肽段Arg-Arg-Val-Arg(RRVR)的氨基酸序列，且含有3，5-双（三氟甲基）苯甲酸(FMBA)的19F核磁共振探针1，以及其对照探针1-Scr。探针1能够被弗林蛋白酶特异性识别剪切，同时双硫键被细胞内谷胱甘肽(GSH)还原为巯基，得到的中间体发生缩合反应，生成具有亲脂性大环内核的二聚体，通过π-π电子堆积自组装形成纳米粒子，导致19F NMR信号因横向弛豫而消失。本文详细阐述了探针的合成路线和方法，并使用HPLC进行纯化分析，高分辨基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(HR-MALDI-TOF/MS)和1H核磁共振波谱对合成的化合物进行表征。酶切缩合后，采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、高分辨质谱、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)等手段对生成的纳米粒子进行了全面的表征。细胞摄取实验表明，设计的探针1能够进入细胞并自组装生成纳米粒子，导致19F NMR信号因横向弛豫而消失，实现了弗林蛋白酶的活性检测。预计该19F核磁共振探针今后可以应用于肿瘤细胞的早期检测。