探索HSPN新月体形成的尿生物标志物及中西医结合治疗对其的影响

摘要

目的：紫癜性肾炎（Henoch-Sch?nlein Purpura Nephritis，HSPN）是过敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein Purpura，HSP）最严重的并发症之一，在儿童继发性肾小球疾病中最为常见。新月体的形成决定了HSPN病情的严重程度及预后。目前，新月体的诊断依赖于肾穿刺活检，此项检查不易在基层医院和儿童患者中普及推广。因此，筛选非创伤性的预示和监测HSPN新月体形成的标志物，并早期干预、阻断新月体形成具有重要意义。尿液具有取样方便、无创等优点，并且可以更加直观的反应肾脏病变。本研究采用蛋白质组学的方法，通过生物信息学分析，发掘HSPN新月体形成早期的尿生物标志物，并观察中西医结合治疗对其的影响。　　方法：收集27例患儿尿样本，分为HSP组、HSPNⅡ型组（无新月体形成），HSPN III型组（有新月形成）3组。其中HSP患儿9例，HSPN（II型）患儿6例，HSPN（ III型）患儿12例。尿液收集后2000r/min离心10分钟后取上清，所得尿样本用超速离心的方法提取尿蛋白，溶液内酶解后萃取肽段，用蛋白质组学高效液相色谱串联质谱（High Performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法进行质谱分析。利用Proteome Discover软件（Mascot2.3搜索引擎）进行数据库检索，确定蛋白的性质。采用labelfree相对定量的方法及intensity based absolute quantification（iBAQ）算法计算出相应蛋白的丰度。利用倍数分析法（ratio>2或<0.5）和秩和检验（p<0.05）的统计学方法，用HSPN（III型）组分别与HSP组、HSPN（II型）组比较筛选差异蛋白。结合Gene Ontology分析等生物信息学分析结果及文献查询，明确差异蛋白与新月体形成的关系。观察HSPN III组患儿治疗前后24h尿蛋白定量及血液中PT、TT、APTT、FIB、D-Dimer、FDP等凝血相关指标的变化。对比HSPN（III型）治疗前后差异蛋白的变化，观察凉血解毒活血法联合西医治疗对其的影响。　　结果：在unique peptide&strict peptide≥1的条件下，HSP组共鉴定1476个蛋白；HSPN（II型）组共鉴定到962个蛋白；HSPN（III型）组共鉴定1156个蛋白。采用统计学方法，用HSPN（III型）组分别与HSP组、HSPN（ II型）组比较，筛选到差异蛋白13个。其中上调蛋白7个，下调蛋白6个。上调蛋白为S100钙结合蛋白A9（S100 calcium binding protein A9，S100A9）、S100钙结合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）、纤维蛋白原γ链(fibrinogen gamma chain，FGG)、纤维蛋白原β链(fibrinogen beta chain，FGB)、膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）、基质金属蛋白酶7(matrix metallopeptidase7，MMP7)、syndecan1（SDC1）。通过Gene Ontology分析在上调蛋白中主要富集到2条生物学过程，分别为凝血及细胞外基质。中医凉血解毒法联合西医治疗能够降低HSPN（III型）患儿24h尿蛋白定量及血液中D-Dimer的含量。S100A9、S100A4、FGG、FGB、ANXA2、MMP7、SDC1，7种蛋白在治疗后变化不明显。　　结论：⑴尿中S100A9、S100A4、FGG、FGB、ANXA2、MMP7、SDC1，7种蛋白的升高可能作为HSPN新月体形成的生物标志物；⑵炎症与纤溶系统可能参与了的肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）损伤与新月体的形成；⑶中医凉血解毒法联合西医治疗能够有效减轻HSPN（III型）病变的临床症状，能够减少蛋白尿、改善高凝状态。

目录

声明

中英文缩略词对照简表

前言

对象与方法

1 一般资料

2 实验材料与方法

3 统计学方法

结果

1 一般资料

2 实验重复性验证

3 蛋白个数统计及相关性分析

4 差异蛋白筛选

5 HSP组及HSPN组尿中凝血酶与纤溶酶统计结果

6 中医凉血解毒法联合西药治疗HSPN（III型）的效果评价

讨论

1 S100A9、S100A4、FGG、FGB、ANXA2、MMP7、SDC1，7种蛋白的生物信息学分析

2 从7种差异蛋白之间的相互关系分析炎症与纤溶系统介导下的肾小球GBM损伤与新月体形成的关系

3中医凉血解毒活血法联合西药治疗HSPN(III型)的效果

结论

参考文献

不足与展望

致谢

附录1

附录2（综述）:肾脏新月体形成的机制及尿生物标志物的研究进展

附录3在校期间论文著作和科研情况