冬凌草二萜类物质合成途径中相关功能基因分析

摘要

目的：　　1.选取合适的冬凌草材料进行转录组技术分析；2根据冬凌草转录组数据分析并选择冬凌草甲素、冬凌草乙素合成途径中 DXR、IDI、ISPF、ISPH基因，进行大肠杆菌克隆、测序分析，获得正确的基因序列信息；3.针对克隆测序的基因，分析其生物信息；4.分别对冬凌草无菌苗做不同部位的基因相对表达量分析；5.做原核表达分析，验证克隆测序后基因的翻译蛋白分子量大小，并为后期蛋白功能分析奠定基础。　　方法：　　1.首先将含冬凌草甲素、冬凌草乙素较低产地的冬凌草无菌苗进行炼苗，使之能在室温环境下进行生长，然后分别在冬凌草叶片表面喷施不同浓度的茉莉酸甲酯，测量喷施后0h、6h、12h、24h、48h、72h后的冬凌草甲素含量，进而确认含量变化最高点的材料。　　2.获得冬凌草转录组数据后，根据冬凌草二萜类物质合成代谢路径，分别选择5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(l-deoxy-D- lxyluloses-phosphatereduet oisomerase,DXR）、异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)、2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶（2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase ISPF）、二甲基烯丙基焦磷酸合成酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase ISPH）并分别设计克隆引物，做大肠杆菌克隆测序分析，获得正确基因序列。　　3.根据测序结果，在线 BLAST同源性基因序列并采用在线软件进行蛋白翻译和生物信息分析。　　4.分别设计 qRT-PCT引物，用荧光定量 PCR仪做冬凌草无菌苗不同部位和添加刺激剂后胁迫诱导的表达量分析。　　5.针对 DXR、IDI、ISPF、ISPH基因设计原核表达引物，采用 PET-28a载体、BL21感受态细胞，做原核表达分析。　　结果：　　1.添加不同浓度的刺激剂后发现在36h内冬凌草甲素含量变化不明显，因此采用本实验室前期多不同产地冬凌草的品质评价后的含冬凌草甲素、冬凌草乙素较高（DLC-G）产地的冬凌草和含冬凌草甲素、冬凌草乙素较低（DLC-D）产地的冬凌草作为冬凌草转录组测序材料。　　2.分别提取冬凌草 DLC-G、DLC-D样品的 mRNA,以 mRNA为模板，研究得到 cDNA文库。以 cDNA文库作为转录组测序材料进行测序分析。DLC-G获得50934276 reads， GC含量为48.06%；DLC-D获得61561674 reads， GC含量为48.13%。共获得44626条 unigenes。对 GLC-G、GLC-D差异基因的表达分析表明， DLC-G、DLC-D2个样品共找到差异表达基因1298条，上调基因有339条，下调基因959条。　　3.DXR、IDI、ISPF、ISPH基因经过大肠杆菌克隆测序分析，获得了基因的序列，测序后的基因片段通过在线 BLAST同源基因，最终确定下来了所选择基因（DXR、IDI、ISPF、ISPH）的基因序列信息。　　4.序列翻译后，发现 DXR基因开放阅读匡为1422bp，编码473个氨基酸组成的蛋白质序列，蛋白分子量为51390.2，等电点为6.09；IDI基因开放阅读匡为906bp,编码301个氨基酸组成的蛋白质序列，蛋白分子量为27444.3，等电点为5.06；ISPF基因开放阅读匡为708bp，编码196个氨基酸组成的蛋白质序列，蛋白分子量为20870.1，等电点为6.75；ISPH基因开放阅读匡为1389bp，编码462个氨基酸组成的蛋白质序列，蛋白分子量为52094.0，等电点为5.82。　　5.不同部位基因表达量分析发现 DXR基因在茎的表达量相对于根、叶较高，基本是其2倍，I D I基因在叶中的表达量较高，而在根和茎的表达量相差不大， ISPF基因在叶中的表达量最高，基本是在根中表达量的5倍，而其在茎中的表达量也基本是在根中表达量的3.8倍,ISPH基因在根、茎、叶中的表达量基本相同，三者之间差别不大；对于胁迫表达分析，茉莉酸甲酯促进 DXR等4条基因的表达，只是表达量不明显，而赤霉素 ATP、稀土元素镧和铈抑制其表达，其中赤霉素的抑制作用最强。　　6.通过 IPTG诱导表达过夜后，做蛋白 SDS-PAGE分析，诱导出了 DXR、ISPF、DXS基因蛋白。

目录

声明

前言

一． 转录组技术应用现状

二．植物二萜类生物合成途径研究现状

三．冬凌草研究进展

研究路线和内容

实验一 转录组材料筛选

1 冬凌草炼苗

2 冬凌草植株添加刺激剂后含量变化分析

3 结果讨论与分析

实验二 冬凌草转录组数据分析

1 建库测序分析

2 对上机测序结果进行评估

3 拼接组装后，对拼接的结果进行功能基因注释

4.采用以上数据库，我们对冬凌草转录组拼接、注释后的 Reads 分别用GO、 KOG 、KEGG 三类分类法进行分类

5 蛋白 CDS 预测

6 SSR 分析

7 基因表达水平分析

8.基因差异表达分析

9 差异基因筛选

10 差异基因富集分析

11 讨论与分析

实验三：冬凌草二萜类生物合成路径相关基因的克隆测序

1 试验材料、菌株及试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 结果讨论与分析

实验四：克隆基因生物信息学分析与系统树构建

1 实验方法

2 实验结果

3 结果讨论与分析

实验五：克隆基因的组织特异性表达分析和胁迫基因表达分析

1 基因组织特异性表达分析

2 克隆基因胁迫表达分析

3 讨论与分析

实验六： 冬凌草基因原核表达分析

1 实验仪器与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 结果讨论与分析

讨论与总结

致谢

参考文献

附件 1

附件 2

附件 3 综述