CD3bright CD56+ T细胞参与慢性HBV病人干扰素治疗无应答和不同NK细胞中miRNA调控研究

摘要

第一部分HBV治疗临床研究
　　乙肝病毒(HBV)感染在全世界范围普遍存在，虽然乙肝疫苗早在上世纪八十年代开发并应用，但全球仍有3.5亿人是慢性乙肝病毒携带者。而中国更是乙肝病毒感染大国，有接近1亿人次。慢性乙肝病毒感染(CHB)严重影响着大众的健康，患者有较高的风险罹患肝脏相关疾病，包括肝脏代谢失调、肝纤维化、肝硬化、严重者甚至发生原发性肝癌。因此，寻找有效的方法治疗慢性HBV感染非常重要。
　　乙肝病毒在肝脏中的复制是导致肝损伤和疾病的重要原因，所以控制乙肝病毒的病毒载量和相关抗原的表达成为治疗的主要手段。目前为止，临床普遍应用的乙肝感染治疗方法分为三类，长效干扰素;核苷/核苷类似物抗病毒药物;干扰素联合抗病毒药物治疗。其中长效干扰素具有免疫调节的活性，治疗效果相对较好。然而对于e抗原阳性的CHB病人，48w的peg-IFNα治疗后持续应答率仅占30％左右。乙肝临床治疗效果很差，直接反应了机体（尤其是肝脏）的免疫系统免疫应答功能发生失调。
　　CD56+T细胞在肝脏中所占T细胞的比例高达50％，可以通过分泌IFNγ抑制HBV病毒复制。而且CD56+T细胞是抗病毒因子IFNγ的重要来源，甚至多于NK细胞，是主要的抗病毒免疫细胞。然而HBV感染后干扰素治疗效果较差，提示我们拥有抗病毒的效应CD56+T细胞可能存在不同的状态，并且在HBV感染和治疗过程中处于相对抑制状态。
　　因此，课题研究目的是探究CD56+T细胞群体在HBV病人感染及治疗过程中的作用，揭示长效peg-IFNα临床治疗慢性HBV感染效果不佳的原因，同时希望为HBV临床治疗提供一个预测指标。
　　基于以上研究目的，临床选取了85例HBeAg阳性的慢性HBV感染病人，通过Peg-IFNα持续治疗48w，之后随访观察24w。在不同时间点(0w、12w、24w、36w、48w、60w、72w)对病毒学指标和免疫学指标进行动态观测。经过系统的统计和整理分析,取得了以下研究结果:
　　1、慢性HBV感染病人多数呈现CD3brightCD56+T细胞状态
　　CD56+T细胞在抵抗病毒感染的同时，可能发挥着免疫调控作用。为了进一步研究CD56+T细胞在CHB病人中的状态，通过流式细胞术的方法分析了HBV病人和正常人外周血的CD56+T细胞，结果发现HBV病人相比于正常人，外周血CD56+T细胞的CD3荧光强度表达明显较高。根据CD56+T细胞上CD3的荧光强度表达，把病人分为两种类型，一种是拥有CD3brightCD56+T细胞的CHB病人，一种是拥有CD3dimCD56+T细胞的CHB病人。在所有的85例CHB病人中，64.7％(55/85)比例呈现CD3brightCD56+T细胞类型;对应的，正常人33例样本中，30.3(10/33)比例呈现CD3brightCD56+T细胞类型。以上结果显示CHB病人多数呈现CD3brightCD56+T细胞状态。
　　2、拥有CD3brightCD56+T细胞类型的CHB病人临床治疗效果较差
　　接下来探究CHB病人CD3brightCD56+T细胞类型的存在是否与临床干扰素治疗效果有相关性。首先，在所有的69例有完整临床治疗数据的CHB病人中，发现拥有CD3brightCD56+T细胞类型的CHB病人临床指标处于相对偏高状态。其次，很大比例(89.4％)的拥有CD3brightCD56+T细胞类型的CHB病人干扰素治疗48w之后呈现无持续应答状态，相比之下，仅有59.1％的拥有CD3dimCD56+T细胞类型的CHB病人呈现无应答。最后，无应答病人的CD56+T细胞多呈现CD3荧光强度较高的状态。以上结果说明拥有CD3brightCD56+T细胞类型的CHB病人多数呈现对干扰素无应答。
　　3、CD3brightCD56+T细胞低表达CD8分子
　　根据拥有CD3brightCD56+T细胞的乙肝病人临床治疗效果差，猜测CD3brightCD56+T细胞应该处于功能相对低下状态。分析了一些功能性相关指标，发现了CD8分子在CD3brightCD56+T细胞的表达明显低于在CD3dimCD56+T细胞的表达。进一步研究发现，干扰素治疗不会改变CD3brightCD56+T细胞低表达CD8分子的状态。从治疗效果角度，无应答病人CD56+T细胞表达CD8分子也相对较低。总之，干扰素治疗的整个过程，CD3brightCD56+T细胞均低表达CD8分子，而无应答病人拥有较少的CD8+CD56+T细胞。
　　4、CD3brightCD56+T细胞高表达NKG2A/CD94分子
　　为了进一步研究CD3brightCD56+T细胞是否处于抑制状态，检测了一些NK细胞及T细胞领域的抑制性分子的表达情况。发现NKG2A/CD94分子在CD3brightCD56+T细胞的表达明显高于在CD3dimCD56+T细胞的表达。进一步研究发现，干扰素治疗不会改变CD3brightCD56+T细胞高表达抑制性二聚体NKG2A/CD94的状态。从治疗效果角度，无应答病人CD56+T细胞表达NKG2A/CD94分子也相对较高。总之，干扰素治疗的整个过程，CD3brightCD56+T细胞均高表达NKG2A/CD94分子，而无应答病人拥有较少的NKG2A/CD94+CD56+T细胞。
　　5、CD3brightCD56+T细胞抗病毒能力较差
　　研究报道IFNγ对于机体抗病毒应答非常重要，而peg-IFNα可以诱导多种免疫细胞产生IFNγ。根据前面结果所观测的表型，预测CD3brightCD56+T细胞抗病毒能力较差。通过体外刺激CHB病人的CD3brightCD56+T细胞和CD3dimCD56+T细胞，检测分泌IFNγ和CD107a的区别。发现CD3brightCD56+T细胞分泌IFNγ和CD107a的能力均较弱。并且干扰素治疗不会改变CD3brightCD56+T细胞低表达抗病毒细胞因子的状态。由此，证明CD3brightCD56+T细胞抗病毒能力相对较差。
　　6、peg-IFNα过程中，CD3brightCD56+T细胞表面Tim-3表达迅速上升
　　在CHB病人中，Tim-3分子高表达可以抑制很多效应细胞的功能发挥，包括NK细胞、CD8+T细胞等。然而，干扰素治疗之前，Tim-3在CD3brightCD56+T细胞和CD3dimCD56+T细胞表面的表达并没有发现区别。反而在peg-IFNα治疗的过程中，CD3brightCD56+T细胞表面Tim-3表达迅速上升，而CD3dimCD56+T细胞表面Tim-3表达平稳。Tim-3在CD3brightCD56+T细胞表面的变化与IFNγ有很明显的负相关关系。由此，推测CD3brightCD56+T细胞的功能抑制性分子Tim-3在干扰素治疗后迅速表达上调，可能导致了CD56+T细胞表现出来的功能缺失，IFNγ分泌降低。
　　综上所述，第一个发现了慢性HBV感染病人中存在一群CD3brightCD56+T细胞，表型和功能上处于抑制状态。这群细胞的存在与临床干扰素应答低下密切相关，大比例的CD3brightCD56+T细胞类型CHB病人为干扰素无应答，可以作为一个辅助的干扰素应答情况的预测指标。另外，干扰素治疗过程中，Tim-3在CD3brightCD56+T细胞迅速上调，可能是CD56+T细胞功能失调的重要原因，部分的解释了CHB病人干扰素治疗效果差的原因。
　　第二部分NK细胞基础研究
　　NK细胞是生物机体抗肿瘤和感染第一防线。不同组织器官中，NK细胞表现出不同的发育和功能状态。比如，蜕膜组织中存在相对未成熟、以产生细胞因子为主的CD56bright NK细胞;外周循环中存在相对成熟、以发挥杀伤效应为主的CD56dim NK细胞。
　　microRNA，是一类非编码短小RNA，生物机体内起着非常广泛的调控作用。已有一些研究报道了miRNA调控NK细胞的发育和功能，但是研究不同状态NK细胞miRNA差异表达调控的相关报道相对较少。
　　这部分工作，研究重点放在三种不同NK细胞—外周血NK(pNK)、脐血NK(cNK)、蜕膜NK（dNK）—miRNA特异性表达和差异表达的研究。并据此，发现miR-362-5p是NK细胞功能调控的一个重要miRNA。具体结果展开如下:
　　1、NK细胞特异性表达miRNA分析
　　对不同淋巴细胞的miRNA基因芯片进行了分析，发现了dNK、cNK和pNK细胞特异性高表达差异两倍以上的miRNA;进一步分析，揭示了在三种NK细胞中均高表达两倍以上的七个miRNA，其中之一是miR-362-5p。
　　2、NK细胞间差异表达miRNA分析
　　接下来，又对三种不同状态NK细胞间进行miRNA差异表达分析。在三种NK细胞间两两比对，发现dNK与pNK细胞差异最明显。进一步发现miR-362-5p在pNK细胞高相对表达，表明miR-362-5p可能参与NK细胞功能的调控。
　　3、CYLD是NK细胞中miR-362-5p的靶基因
　　根据以上结果，选定miR-362-5p作为研究对象。首先需要确定miR-362-5p在NK细胞中发挥功能的靶基因。应用TargetScan网站预测miR-362-5p潜在的靶基因，通过双荧光素酶报告实验证明了CYLD是miR-362-5p直接作用的靶基因，PCR和蛋白印记方法进一步证明了在NK细胞内miR-362-5p同样可以调控CYLD的表达。
　　4、过表达或者抑制miR-362-5p可以通过CYLD调控NK细胞的功能
　　接下来研究miR-362-5p对NK细胞的作用，通过核转染的方法向蜕膜NK细胞中导入miR-362-5p的模拟物，发现可以促进NK细胞的相关效应功能;又向外周血NK中导入miR-362-5p的抑制剂敲低miR-362-5p，结果发现NK细胞杀伤功能和分泌细胞因子能力明显降低。进一步研究发现miR-362-5p对于NK细胞的功能调控是通过靶向CYLD实现的。该结果显示了miR-362-5p可以正向调控NK细胞发挥功能。
　　综上所述，我们的工作提供了不同状态NK细胞（dNK、cNK、pNK）中miRNA的表达特异性，为日后不同NK细胞亚群中分子调控的研究提供了便利。另外，发现了miR-362-5p可以调控NK细胞功能。研究为NK细胞miRNA调控研究提供了很好的视野和研究基础。

目录

声明

摘要

符号说明

图序

第1章 绪论：CD56+ T细胞与HBV临床治疗

1．1 HBV感染与治疗

1．1．1 HBV病毒学特征

1．1．2 HBV感染进程

1．1．3 HBV免疫应答

1．1．4 HBV免疫逃逸

1．1．6 HBV临床治疗

1．2 CD56+ T细胞

1．2．1 CD56+ T细胞特征

1．2．2 CD56+ T细胞抗病毒研究

第2章 绪论：miRNA与NK细胞

2．1 NK细胞

2．2 microRNA

2．2．1 miRNA基本特征

2．2．2 调控NK细胞的miRNA

第3章 CD56+ T细胞与HBV病人干扰素治疗应答关系研究

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 CHB病人优势表达CD3brightCD56+ T细胞

3．3．2 表达CD3brightCD56+ T细胞的CHB病人治疗效果不佳

3．3．3 CD3brightCD56+ T细胞处于被抑制性状态

3．3．4 治疗过程中，TIM-3在CD3brightCD56+ T细胞表达迅速上调

3．3．5 附表HBV治疗病人临床资料信息

3．4 讨论和总结

第4章 不同NK细胞亚群间miRNA芯片差异分析

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验器材

4．2．3 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 miRNA的芯片谱系分析

4．3．2 NK细胞之间的miRNA表达谱系

4．3．3 CYLD是miR-362-5p的靶基因

4．3．4 miR-362-5p调节NK细胞功能

4．4 讨论和总结

参考文献

致谢

攻读博士期间研究成果和参加的学术会议