siRNA沉默HMGA2对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

摘要

目的：运用RNA干扰技术，在人胚肺成纤维细胞（MRC-5）中将肺纤维化相关基因HMGA2沉默，取矽肺患者肺泡巨噬细胞的上清培养液刺激MRC-5，观察MRC-5细胞中I型和III型胶原的表达情况，探讨HMGA2在矽肺纤维化发生发展过程中的作用。　　方法：　　1、矽肺患者肺泡巨噬细胞（AM）的获取：对II期矽肺患者进行全麻下双肺灌洗获取肺泡灌洗液，经过滤、离心、PBS洗涤等过程，之后做HE、抗酸及瑞氏染色鉴定该细胞，置于10％FBS的DMEM培养基中继续体外培养。2、SiO2刺激肺泡巨噬细胞（AM）上清液的获取：在无血清培养基DMEM中加入SiO2后继续培养肺泡巨噬细胞。18h后收集培养上清液，过滤后冷冻保存。3、干扰载体的构建：以pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH为载体，经上海吉玛公司构建HMGA2干扰载体及其对照载体。4、HMGA2干扰效率的检测：干扰载体经转染试剂LipofectamineTM2000介导分别转入人胚肺成纤维细胞MRC-5内，转染24h~48h后激光共聚焦显微镜观察转染效率。提取细胞总mRNA和总蛋白，经RT-PCR和Western-blot检测出最佳干扰效率的载体用于后续试验。5、实验分为以下4组：空白对照组（C），含10%FBS的DMEM常规培养基培养人胚肺成纤维细胞MRC-5；刺激组（S），使用经SiO2粉尘刺激培养的AM上清液培养MRC-5；转染组（T），将筛选的最佳干扰质粒载体转染MRC-5后，再加入经SiO2粉尘刺激培养的AM培养上清液培养；阴性转染组（N），将阴性质粒转染MRC-5后，再加入经SiO2粉尘刺激培养的AM培养上清液培养。6、I型和III型胶原蛋白表达的检测：加SiO2刺激AM的培养上清液培养各组人胚肺成纤维细胞，在培养12h、24h、36h、48h和72h后，免疫细胞化学和Western-blot检测其中I、III型胶原蛋白的表达情况。　　结果：1、LipofectamineTM2000∶脂质体质粒=2μg∶3μl转染至人胚肺成纤维细胞MRC-5后24h~48h，激光共聚焦显微镜观察人胚肺成纤维细胞，结果显示90%以上细胞中有绿色荧光蛋白的表达。2、用RT-PCR和Western blot法检测转染干扰载体后各组MRC-5细胞中HMGA2的表达，结果证实HMGA2的最佳干扰载体为pGPU6/GFP/Neo-HMGA2-homo-768；阴性转染组（N）与空白对照组（C）差异无统计学意义。3、免疫细胞化学法和Western blot法检测结果均显示：空白对照组MRC-5细胞中有I型和III型胶原蛋白的表达；刺激组（S）与空白对照组（C）细胞相比，I型和III型胶原蛋白表达均有上调（P＜0.05）；转染组（T）与阴性转染组（N）细胞相比，I型和III型胶原蛋白表达下调（P＜0.05）；阴性转染组（N）与刺激组（S）相比，I型和III型胶原蛋白表达均无明显差异（P＞0.05）,转染组与刺激组相比I型和III型胶原蛋白的表达也有下调（P＜0.05）。　　结论：1、经RNA干扰技术将人胚肺成纤维细胞MRC-5中HMGA2沉默后，其经AM上清液刺激而产生的I型和III型胶原蛋白表达受到明显抑制。2、在人胚肺成纤维细胞MRC-5中下调HMGA2的表达可为矽肺的治疗提供理论依据。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料

1.1.2 矽肺患者AM条件上清液的制备

1.1.3 人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的培养

1.1.4 HMGA2基因干扰质粒的构建

1.1.5 质粒转染及转染率的测定

1.1.6 RT-PCR在人胚肺成纤维细胞中检测干扰HMGA2的效率

1.1.7 Western blot法检测干扰质粒对HMGA2的干扰效率

1.1.8 免疫细胞化学法检测I、III型胶原蛋白

1.1.9 Western blot法检测I、III型胶原蛋白

1.2 结果

1.2.1 矽肺患者AM细胞的鉴定

1.2.2 人胚肺成纤维细胞MRC-5的形态观察

1.2.3 重组质粒的测序结果

1.2.4 激光共聚焦显微镜观察质粒转染率

1.2.5 RT-PCR检测干扰后HMGA2的表达

1.2.6 Western blot法检测干扰后HMGA2的表达

1.2.7 免疫细胞化学法检测人胚肺成纤维细胞中I、III型胶原的表达

1.2.8 Western blot法检测人胚肺成纤维细胞中I、III型胶原的表达

1.3 讨论

1.4 结论

参考文献

第2章 综 述:矽肺的研究进展

2.1矽肺的流行病学

2.2矽肺的发病原因

2.3矽肺的相关病变

2.4矽肺的病理学特征

2.5矽肺的诊断

2.6矽肺的治疗

参考文献

致谢

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