舒肝宁对酒精性肝纤维化作用的实验研究

摘要

目的：研究舒肝宁对酒精性肝纤维化的作用以及其作用机制,为临床应用提供实验依据。　　方法:（1）取雄性Wistar大鼠50只，予“酒精—吡唑—玉米油”混合液灌胃（1次/天）复制酒精性肝纤维化大鼠模型；另取同批大鼠10只，予生理盐水灌胃作对照组。16周后将存活的造模大鼠（n=40）随机分成模型组、舒肝宁高、中、低剂量组及安络化纤丸组，每组各8只。对照组、模型组腹腔注射生理盐水5 mL·kg-1，舒肝宁高、中、低剂量组分别腹腔注射舒肝宁注射液4.8 mL·kg-1、2.4 mL·kg-1、1.2 mL·kg-1。安络化纤丸组灌胃安络化纤丸0.75 g·kg-1，各组动物每天给药1次，连续治疗8周。治疗期间，造模动物继续造模给药。末次治疗给药后24 h，各组大鼠心脏取血，分离血清，用微板法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶（AST）水平；用化学发光法检测血清中肝纤维化四项指标：血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PⅢNP）和Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）。取血后处死大鼠，取肝组织，称重，计算肝指数；取一小块肝组织制备成肝组织匀浆，取上清检测丙二醛（MDA)和超氧化物歧化酶（SOD)水平，剩余肝组织固定于10%中性福尔马林中，经脱水、石蜡包埋、切片、行苏木精-伊红（HE)染色和Masson染色，镜下观察肝脏病理学改变及肝纤维化情况。（2）建立大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)细胞活化的体外模型。采用MTT法观察舒肝宁对HSC-T6细胞增殖的影响，并筛选出合适的药物浓度和作用时间；选择舒肝宁作用浓度为2.5%、1.25%、0.625%作为高、中、低剂量组，与HSC-T6细胞孵育24 h,并设正常对照组（含等体积的培养基），流式细胞仪（FCM)检测不同药物浓度对HSC-T6细胞凋亡的影响；qPCR检测不同药物浓度对HSC-T6细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA表达的影响。　　结果：（1）大鼠一般情况：对照组大鼠精神状态较好，活动自如，被毛干净有光泽，饮水进食正常，大小便无异常。造模组大鼠灌胃酒精混合液后初表现为兴奋，后进入嗜睡状态，造模3周后活动逐渐减少，并出现毛色暗淡、发黄、脱毛、竖毛等现象，饮水进食减少，稀便。给予不同剂量的舒肝宁及安络化纤丸治疗后，大鼠精神状态、活动情况、被毛、饮水进食量以及大小便情况均明显改善。与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平明显升高（P<0.05orP<0.01），HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C含量显著上升（P<0.05orP<0.01），大鼠体重明显下降（P<0.05），肝指数明显升高（P<0.01），肝组织MDA含量显著上升（P<0.01），SOD含量明显下降（P<0.01）；与模型组比较，舒肝宁高、中、低剂量组及安络化纤丸组大鼠血清 ALT、AST水平明显降低（P<0.05orP<0.01），HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C含量明显下降（P<0.05orP<0.01），大鼠体重明显升高（P<0.05），肝指数明显下降（P<0.01），肝组织MDA含量显著下降（P<0.05orP<0.01），SOD含量明显上升（P<0.05orP<0.01）；肝组织病理学检测显示：肉眼观察见对照组大鼠肝脏大小适中，在自然光照下呈深红色，表面光滑柔软，边缘锐圆。模型组大鼠肝脏明显肿大，在自然光照下呈暗红色或黄褐色，表面粗糙可见细小结节，质地较脆，边缘发钝。给药组大鼠肝脏稍肿大，在自然光照下呈暗红色，表面稍粗糙，质地中等。HE染色可见，对照组见肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整；模型组肝组织脂肪变性，大量肝细胞呈现空泡化，并有点、灶状坏死伴炎细胞浸润，汇管区周围有大量纤维组织沉积，部分肝小叶结构被破坏；各给药组肝组织脂肪变性、肝细胞坏死、炎细胞浸润及汇管区沉积的纤维组织均较模型组有不同程度的减少。Masson可见，肝细胞被染成红色，胶原纤维被染成绿色，对照组汇管区有少许胶原纤维存在，模型组有大量胶原纤维呈绿色沉积在汇管区，破坏了部分肝小叶结构。各给药组绿色胶原纤维分布的范围明显减少，尤以舒肝宁中高剂量组纤维化改善更明显。（2）舒肝宁对 HSC-T6细胞的增殖具有明显的抑制作用，而且随着药物浓度的增加和刺激时间的延长，抑制作用更加明显，表现出一定的量效关系及时效关系。FCM检测结果显示，舒肝宁低、中、高剂量组的早期凋亡率及中晚期凋亡率与死亡率均升高，中、高剂量组与对照组比较差异具有统计学差意义（P<0.05）；qPCR结果显示舒肝宁药物组能够显著抑制HSC-T6细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA的表达，与对照组比较，差异极具显著性（P<0.01）。　　结论：舒肝宁有抗酒精性肝纤维化的作用，其作用机制可能与保护肝细胞、减少细胞外基质（ECM）的分泌、抑制脂质过氧化、抑制HSCs活化、诱导HSCs凋亡以及抑制HSCsⅠ和Ⅲ型胶原mRNA的表达有关。

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英文缩略词表

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.2 大鼠体重、肝湿重，肝指数

2.3 大鼠血清ALT和AST的活性

2.4 大鼠肝纤维化四项水平

2.5 大鼠肝组织MDA和SOD水平

2.6 肝组织病理学观察

2.7舒肝宁对HSC-T6细胞增殖的影响

2.8 舒肝宁对HSC-T6细胞凋亡的影响

2.9 舒肝宁对HSC-T6细胞collageⅠ及collageⅢ的mRNA转录水平的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

综述：酒精性肝纤维化发生机制的研究进展

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致谢

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