从p38MAPK信号通路探讨MEBT/MEBO对大鼠慢性难愈合创面的修复机制

摘要

目的：从p38MAPK信号通路探讨皮肤再生医疗技术（MEBT/MEBO）对大鼠慢性难愈合皮肤创面的修复机制。　　方法：　　（1）实验一：SPF级10～12周，体重在220g～250g之间，SD雄性大鼠40只，一周适应性喂养，按照随机原则抽取10只大鼠作为空白组，空白组大鼠仅作皮肤全层切除，不再进行药物干预。剩余30只大鼠注射醋酸氢化可的松形成慢性难愈合创面模型，随机分为模型组、MEBO组和贝复济组，每组10只。造模后第二天用药治疗。换药前各组均以1/5000呋喃西林溶液清洁创面，每天换药2次。在造模后第3天、第7天、第14天观察创面情况、测量并计算各组创面愈合率，观察计算创面愈合时间。　　（2）实验二：同实验一要求的大鼠80只，按照随机原则抽取20只大鼠作为空白组，同实验一的造模方法，剩余60只大鼠随机分为模型组、MEBO组和贝复济组，每组20只。造模后第二天用药治疗。换药方法及次数同实验一。在造模后第3天、第7天、第14天各组随机处死5只，取皮肤创面组织，一部分用10％福尔马林固定以作病理切片，剩余部分立即放于液氮罐中，稍后迅速转入-80℃超低温冰箱。待标本收集完毕做后续的Western blotting、RT-PCR、ELISA方法检测。　　结果：　　（1）创面大体情况：空白组创面恢复最好，MEBO组、贝复济组情况显著优于模型组。　　（2）创面愈合时间：空白组愈合时间最短（13.40±0.74d），与模型组相比有显著差异（P＜0.01），模型组所需时间最长（22.19±2.09d），与各组相比有显著差异（F=141.900，P＜0.01），MEBO组愈合时间与贝复济组无显著差异（P＞0.05）。　　（3）创面愈合率：在第3d，7d，14d，空白组愈合率与模型组相比有显著差异（P＜0.05）；在第7d、第14d，MEBO组、贝复济组与模型组愈合率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；MEBO组与贝复济组比较，在第3d、14d，差异无统计学意义（P＞0.05），但在第7d相比，有显著差异（P＜0.05）。　　（4）Western blotting：①在整个创面愈合过程中，实验二各组大鼠创面肉芽组织中p38、MK2的含量呈逐渐递减趋势（P＜0.01），造模后第3天、第7天、第14天各时相点各组大鼠创面肉芽p38、MK2表达均无差异（P＞0.05）；②在创伤早期，模型组、MEBO组、贝复济组创面组织中p-p38、p-MK2表达差异无统计学意义（P＞0.05）；在造模后第7天，各组间的差异开始明显，空白组、MEBO组、贝复济组表达量开始显著下降，模型组下降趋势不明显，各组两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后第14天，相比其他三组，模型组表达量仍处于较高水平（P＜0.05），MEBO组和贝复济组差异无统计学意义（P＞0.05）。　　（5）RT-PCR：在整个实验过程中，与空白组相比，MEBO组、贝复济组、模型组的P38 mRNA、MK2 mRNA表达量在第3天时最多，随后持续下降；造模后第3天，各组差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后第7天，MEBO组、贝复济组的表达量下降趋势明显，两组之间有明显统计学差异（P＜0.05）；造模后第14天，MEBO组、贝复济组的表达量持续下降，两组之间无统计学差异（P＞0.05），但与模型组相比均有差异（P＜0.05），模型组仍处于高表达。　　（6）ELISA：在实验过程中各组大鼠创面组织中的TNF-α、IL-6含量随时间均呈下降趋势，但以MEBO组下降最明显，模型组下降最缓慢。造模后第3天，模型组、MEBO组、贝复济组表达量均高于空白组（P＜0.05），造模后第7天，模型组表达量仍高于其他三组（P＜0.05），造模后第14天模型组表达持续明显高于其余各组（P＜0.05）。　　结论：　　（1）MEBT/MEBO能明显缩短大鼠慢性难愈合创面的愈合时间、提高愈合率。　　（2）MEBT/MEBO可以下调慢性难愈合创面组织中p-p38、p-MK2、p38 mRNA、MK2 mRNA的表达水平。　　（3）MEBT/MEBO可以减少慢性难愈合创面组织中TNF-α、IL-6的含量，减轻创面局部炎症反应。终上所述：MEBT/MEBO可能通过下调被过度激活的p38MAP K信号通路中p-p38、p-MK2蛋白表达，阻断部分相关信号转导，减轻炎症反应，调控慢性难愈合创面的细胞免疫、炎症渗出，促进肉芽组织合理增生的过程，从而促进创面愈合。

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引言

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验仪器、药物、试剂

2 实验方法及步骤

2.1 动物模型的建立

2.2 实验动物分组及换药方式

2.3 实验取材

2.4 创面的宏观观察（包括创面大体观察、创面愈合率和愈合时间）

2.5 组织病理切片及方法（常规HE染色）

2.6 Western blotting检测方法与指标测定

2.7 RT-PCR法检测方法与指标测定

2.8 ELISA检测方法和指标测定

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 创面的宏观观察

3.2 组织病理学观察

3.3 各组大鼠创面组织中P38、MK2以及各自磷酸化蛋白水平表达

3.4 各组大鼠创面组织中P38mRNA、MK2 mRNA表达水平

3 .5各组大鼠创面组织中TN F-α、IL-6表达量

4 讨论

4.1 中医对慢性难愈合创面的认识及MEBO/MEBT的原理

4.2 慢性难愈合皮肤溃疡的西医研究

4.3 动物模型和实验药物的选择及意义

4.4 皮肤创面愈合评价标准的选择

4.5 MEBO通过P38MAPK信号通路促进大鼠慢性难愈合创面的愈合

4.6 MEBO通过调节TNF-α、IL-6促进大鼠慢性难愈合创面的愈合分析

4.7 MEBO药物配方、促进创面愈合的分析

4.8 小结

结论

存在的问题与展望

参考文献

缩略词表

综述:p38分子网络调控体表慢性难愈合创面愈合过程的研究进展

致谢

个人简历及攻读学位期间获得的科研成果