毛郁金乙醇提取物降血脂作用的谱效关系研究

摘要

目的:本课题以毛郁金作为研究对象，考察不同产地毛郁金乙醇提取物对高脂血症大鼠的降血脂作用，建立了不同产地毛郁金药材的HPLC指纹图谱，根据毛郁金药材的液相色谱指纹图谱和降血脂作用结果，建立谱效关系模型，直观分析其起降血脂作用的化学成分，最终确定哪些特征峰可以反映其药效;同时采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(UPLC-QTOF-MS)联用技术定性分析毛郁金乙醇提取物中的主要化学成分，并通过HPLC法对鉴定结果进行验证，为阐明相关物质基础，实现中药化学成分与中药药效的统一，科学评价和有效鉴别毛郁金药材与控制其质量提供新方法。　　方法:通过高脂饲料喂养建立高脂血症大鼠模型，连续3周给予毛郁金乙醇提取物进行治疗，设正常组、高脂模型组、辛伐他汀组和10批不同产地毛郁金乙醇提取物给药（生药12g·kg-1·d-1）组，以动物实验研究毛郁金乙醇提取物降血脂的作用。利用HPLC分析方法对广西不同产地的10批毛郁金药材进行指纹图谱分析。采用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”进行数据处理、相似度比较分析，建立并评价毛郁金降血脂活性部位的HPLC指纹图谱。在建立的毛郁金HPLC色谱指纹图谱基础上，采用灰色关联度法和多元线性回归分析研究各色谱与降血脂作用的相关性，构建毛郁金降血脂“化学谱”-“药效”关系。采用WatersAcquity BEH-C18(1.7μm，2.1×100mm)，以0.1％甲酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱;流速为0.4mL/min;检测波长240nm;柱温40℃;进样量3μL，质谱定性采用飞行时间质谱，正、负离子模式扫描。　　结果:毛郁金乙醇提取物给药组对高脂大鼠血清CHOL、TG含量降低作用较弱，而对降低LDL-C、升高HDL-C含量有显著性作用;各产地给药组均对降低LDL-C含量有显著作用(P＜0.01或P＜0.05)，7组产地对升高HDL-C含量有显著作用(P＜0.01或P＜0.05);各产地毛郁金降血脂活性差异不大，灵山县、明阳农场、横县莲塘产地的药材降血脂作用相对较好。建立了10批不同产地毛郁金药材高效液相指纹图谱，以20个共有峰为评价指标，各产地HPLC指纹图谱相似度均大于0.88，说明同一年份采集的不同产地毛郁金药材的成分基本稳定，相似性较高，具有指纹图谱的特征意义。谱效分析结果可知，HPLC指纹图谱中的共有峰中，10，18，13，15，14，17，16，1号峰对降血脂药效有较大关联，对LDL-C降低作用贡献最大的是18号峰（吉马酮），对HDL-C升高作用贡献最大的是10号峰，除共有峰外的其它成分也在影响毛郁金降血脂作用，毛郁金发挥降血脂作用不是靠单个成分的药效进行加合，而是毛郁金“化学成分群”共同作用的结果。通过谱峰的保留时间、一级质谱精确质荷比和二级质谱碎片信息，参考相关文献数据，鉴定出毛郁金乙醇提取物中的6个化学成分，通过HPLC法，测定出莪术二酮、莪术醇、吉马酮、姜黄素和去甲氧基姜黄素，可为毛郁金的成分分析提供依据。　　结论:毛郁金乙醇提取物通过降低LDL-C含量，进而升高HDL-C含量而达到降血脂作用，由于不同产地毛郁金药材的化学成分以及成分含量有所差异，各产地降血脂作用结果不同，但差异不大。建立了毛郁金药材的HPLC指纹图谱，并得到对照指纹图谱，该方法具有重现性好、精密度高的特点，可用于毛郁金药材的鉴别，为质量控制提供依据。各产地毛郁金药材稳定性较好，相似性较高，广西毛郁金药材质量较稳定，可以建立合格的广西毛郁金药材指纹图谱。毛郁金的色谱指纹图谱-降血脂的相关性研究表明，单一或几种化学成分分析方法并不能有效地控制毛郁金质量，毛郁金的降血脂作用是多种成分协同作用的结果，采用多种化学分析方法和现代药理学、分子生物学技术，建立体现整体观的毛郁金药效指纹图谱，提高毛郁金质量控制水平的途径。建立了一种基于UPLC-QTOF/MS技术对毛郁金药材中的化学成分进行鉴别的方法，为控制毛郁金药材的内在质量提供依据。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 毛郁金乙醇提取物降血脂活性研究’

1 实验材料与方法

1．1 实验材料和饲养条件

1．2 实验仪器设备

1．3 主要试剂及试剂盒

2 方法

2．1 不同产地毛郁金乙醇提取物的制备

2．2 脂肪乳剂的制备

2．3 造模及给药

2．4 高血脂大鼠的指标检测

2．5 统计学处理

3 结果与分析

3．1 毛郁金乙醇提取物对大鼠血脂水平的影响

3．2 毛郁金提取物对高血脂症大鼠CHOL的影响

3．3 毛郁金提取物对高血脂症大鼠TG的影响

3．4 毛郁金提取物对高血脂症大鼠HDL-C的影响

3．5 毛郁金提取物对高血脂症大鼠LDL-C的影响

4 讨论

第二部分 毛郁金HPLC指纹图谱的建立

1 实验材料

1．1 试验药材

1．2 实验仪器

1．3 试剂及药品

1．4 分析软件

2 实验方法

2．1 毛郁金供试品的制备

2．2 对照品溶液的制备

2．3 色谱条件的优化

2．4 供试品制备方法的考察

2．5 提取方法的考察

2．6 指纹图谱方法学考察

2．7 指纹图谱的建立与技术参数

2．8 各产地毛郁金药材指纹图谱的采集

2．9 相似度软件处理毛郁金药材指纹图谱

2．10 毛郁金指纹图谱共有峰的标定

3 小结与讨论

第三部分 毛郁金降血脂谱-效关系建模方法研究

1 实验材料

1．1 数据和软件

2 分析方法

2．1 灰色关联度法

2．2 多元线性回归分析方法

3 讨论

3．1 灰色关联度法

3．2 多元线性回归分析方法

4 结论

第四部分 毛郁金乙醇提取物的UPLC-QTOF-MS分析

1 仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 试剂及药品

2 实验方法

2．1 超高效液相色谱条件

2．2 质谱条件

2．3 高效液相色谱条件

2．4 毛郁金乙醇提取物的制备

2．5 对照品溶液的制备

3 结果

3．1 毛郁金样品UPLC-QTOF-MS成分分析

3．2 毛郁金的化学成分鉴定

3．3 根据质谱裂解特征鉴定成分

3．4 高效液相色谱法对化合物验证

4 讨论

第五部分 全文总结

参考文献

附录

综述 毛郁金的研究进展

致谢

个人简介及攻读学位期间获得的科研成果