原发性胆汁性肝硬化模型鼠发病过程中造血系统、细胞因子、肠道菌群的作用研究

摘要

原发性胆汁性肝硬化（简称PBC）是一种由于免疫系统攻击肝内小胆管而引起的慢性胆汁淤积性自身免疫疾病。PBC以对线粒体自身抗原的耐受丢失和小胆管的破坏为特征。晚期病人会出现肝纤维化与肝硬化的发展，严重威胁患者的生命健康。在以往的研究中，我们建立了IL-2Rα(-/-)小鼠作为人类PBC的动物模型。IL-2Rα(-/-)小鼠的血清中出现抗线粒体抗体(AMA)，组织病理学上存在着明显的门脉炎症和胆管破坏，肝脏中存在着CD4+T细胞与CD8+T细胞浸润，多种炎性细胞因子的水平升高。这些结果表明IL-2Rα(-/-)小鼠能够自发自身免疫性胆管炎，并具有多种类似于人类PBC的症状。而且这种小鼠同时自发产生炎症性肠病（简称IBD），因此IL-2Rα(-/-)小鼠也可以用于研究肠道微环境（包括肠道菌群和肠道炎症）与肝脏炎症的相互作用。前期的研究工作显示，在IL-2Rα(-/-)小鼠中敲除CD4会减轻结肠炎症但不影响肝脏炎症，而敲除CD8会减弱胆管破坏和门脉炎症但不影响结肠炎症。在IL-2Rα(-/-)小鼠中可以发现存在着比野生型对照小鼠增强的Th1和Th17型反应。我们的前期工作证明IL-2Rα(-/-)小鼠的血清IL-12p40水平比IL-2Rα(+/-)小鼠要高。IL-12p40是IL-12与IL-23的共同亚基，IL-12与IL-23均属于IL-12家族，IL-12家族在多种自身免疫病中有着较为重要的作用。尤其是在基于人类PBC的全基因组关联分析研究中，IL-12相关基因被发现与PBC相关。但是IL-12p40在PBC中的具体作用尚不清楚。
　　因此我们尝试在IL-2Rα（-/-）小鼠中敲除IL-12p40以研究IL-12p40在PBC中的作用，结果显示相比IL-2Rα(-/-)小鼠，IL-12p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠可以作为一个更好的PBC模型。我们在这个模型之上对于造血干细胞、细胞因子、肠道菌群进行了深入的研究。得到的实验结果如下:
　　1.IL-12p40的敲除加重了IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性胆管炎症并引起肝纤维化
　　令人惊奇的是p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠显示出更加严重的门脉炎症与胆管损伤，但是其肠炎显著减轻。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠高比例出现脾肿大的症状，其脾脏与肝脏细胞数均显著高于IL-2Rα(-/-)小鼠，但肠系膜淋巴结的细胞数要明显低于IL-2Rα(-/-)小鼠。有趣的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的脾脏细胞数与肝脏细胞数呈正相关，但肠系膜淋巴结的细胞数与肝脏细胞数没有关联。我们通过纤维化评分、羟脯氨酸含量测定、免疫组化、实时定量荧光PCR等多种方法证明，与IL-2Rα(-/-)小鼠最突出的区别是p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠能够自发肝纤维化，以此可以模拟PBC患者病程中晚期症状。
　　我们分析了p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的表型，发现T细胞、CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例增高。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏CD8+T细胞主要是效应性记忆性细胞，而IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏CD8+T细胞主要是中枢性记忆性细胞。p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的肝脏CD4+T与CD8+T细胞主要是PD-1+的细胞，而IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏CD4+T与CD8+T细胞主要是PD-1-的细胞。与IL-2Rα(-/-)小鼠相比，p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-10的能力上升，而分泌IL-17A的能力下降。RT-PCR的结果也证明p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠肝脏中Th1型反应增强，Th17反应受到抑制。
　　2.p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的造血系统异常
　　有趣的是，我们发现p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠与野生型小鼠相比，骨髓Lineage-c-Kit+Sca-1+细胞（LSK细胞）的数目和比例都有所增加。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠存在着髓外造血现象，表现在脾脏与肝脏中出现LSK细胞。LSK细胞通常被认为包含有造血干细胞(HSC)和前体细胞。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中的骨髓LSK细胞表型与野生型小鼠相差很大，它们具有更大的细胞体积和颗粒度（高FSC和SSC），更低的CD86表达，并且CD150/CD48与CD34/CD135的表达方式不同。p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓中红细胞、B细胞和NK细胞的比例与数目均降低，提示我们该小鼠的造血干细胞的造血功能存在障碍。令人惊奇的是，p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞高表达MHCⅡ类分子，暗示这群细胞可能作为抗原提呈细胞(APC)行使功能，而野生型小鼠则不会出现类似特征。
　　我们发现p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓T细胞包括CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例与数目均显著升高。我们猜测骨髓T细胞对于LSK细胞的异常起着重要的作用。我们检测年龄较小的小鼠的状态，发现3周与4周时的p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠出现了明显的脾脏肿大、骨髓T细胞浸润和骨髓LSK细胞异常，而2周的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠却没有这些现象。因此我们假设小鼠在离乳后肠道细菌的改变可能通过T细胞来影响骨髓LSK细胞的异常。
　　我们使用骨髓嵌合的方法，对p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力是否改变进行了探究，将Ly5.2 p40(-/-)IL-2Rα（+/-）小鼠与Ly5.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓细胞在用红细胞裂解液处理后以1∶1的比例进行嵌合，转输给致死剂量辐照过的Ly5.1/5.2小鼠中。8周后杀鼠检测各脏器中来自Ly5.1小鼠与Ly5.2小鼠的细胞的比例。结果证明p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠全骨髓的重建能力要低于p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠。我们同样进行了骨髓LSK细胞1∶1嵌合的实验，结果p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠LSK的重建能力要远低于p40（-/-）IL-2Rα(+/-)小鼠，说明p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞很多都是造血功能较弱的前体细胞。
　　3.IFN-γ是p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠造血系统异常的关键细胞因子
　　由于p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓存在着增强的T细胞浸润并且p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的T细胞高表达IFN-γ，我们猜想T细胞来源的IFN-γ对于LSK细胞失调起着至关重要的作用。我们将p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠与IFN-γ（-/-）小鼠杂交得到p40（-/-）IFN-γ(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠，并与p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠进行对比。我们发现p40（-/-）IFN-γ（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠依然存在着肝脏炎症，但是不再出现“巨脾”的现象。p40(-/-)IFN-γ(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的T细胞在肝脏与脾脏中的比例并没有改变，其表型依然处于高度活化状态。然而我们发现在p40（-/-）IFN-γ（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓中浸润的T细胞的比例和数目下降，同时该小鼠骨髓中B细胞与红细胞的比例和数目上升。重要的是，p40（-/-）IFN-γ(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞的比例、数目与表型完全恢复正常，并且几乎不表达MHCⅡ类分子。这证明p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的造血系统异常完全依赖于IFN-γ。
　　4.肠道微生物参与调节p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏炎症与造血系统
　　为了清除肠道中绝大多数的共生菌，我们用含有氨苄青霉素，甲硝唑，新霉素以及万古霉素这四种抗生素的水从4周龄起饲养SPF级的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠。在抗生素喂养8周后，即小鼠12周时杀鼠。结果发现清除肠道微生物可以显著减轻p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的脾肿大和肝脏炎症。清除了肠道菌的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的各脏器T细胞的比例和数目下降，并且T细胞的效应性记忆细胞的比例下降，其分泌IFN-γ的能力也下降。清除了肠道菌的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞的比例和数目下降，一些LSK细胞异常的特征也得到一定程度的改善。这些数据证明了肠道共生菌在p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中能够促进肝脏炎症和骨髓造血系统异常。
　　我们提取了p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠与p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠的结肠中粪便的基因组DNA，通过qPCR检测16S RNA类型来测定一些种类细菌的含量。我们将p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠根据脾脏重量分成巨脾和非巨脾的2组，并将它们的结果与p40(-/-)IL-2Rα（+/-）小鼠进行对比。有意思的是，非巨脾的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的放线菌门、β-变形菌纲、γ-变形菌纲与乳酸杆菌群的含量比起巨脾的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠和p40（-/-）IL-2Rα(+/-)小鼠有所增高，而我们并没有观察到巨脾的p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠和p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠之间存在着差异。非巨脾的p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠中失调的肠道菌群可能对于炎症起到了抑制的作用。但是具体是那些细菌在p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中起到何种作用尚不清楚。
　　综上所述，本研究发现p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性胆管炎加重同时结肠炎减轻，并且能够自发肝纤维化，因此比起IL-2Rα(-/-)小鼠能够更好的模拟人类PBC。本研究还发现了p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的造血系统异常，出现了高表达MHCⅡ类分子的造血干细胞样细胞，而这些现象依赖于IFN-γ并且受肠道共生菌调节。利用该疾病模型中可以探讨自身免疫性肝病中，肝脏炎症与造血系统、细胞因子、肠道微环境之间的关系，这为研究PBC的致病机制以及寻找有效的治疗靶点提供了理论依据。