肠道共生菌群调控小鼠肝脏再生的机制研究

摘要

哺乳动物的肠道内存在着种类和数量繁多的共生菌群，它们既可以被免疫系统所调控，又可以影响免疫系统细胞的组成比例和免疫应答反应。肠道共生菌群不仅参与调控肠道内的免疫系统应答以及肠道相关的疾病，也可以参与调控肺脏、肝脏和皮肤等身体其它器官的免疫应答反应以及相关的炎症。来源于肠道共生菌群的代谢产物以及食物抗原可以通过门静脉直接进入肝脏，对肝脏的炎症和免疫应答进行调控。肠道共生菌群被发现可以参与肝癌、自身免疫性肝炎以及非酒精性脂肪肝的发生过程，也被认为可以促进肝脏再生的过程，然而其中的免疫学机制目前研究得并不是很清楚。
　　在本文的研究中，我们在小鼠的饮用水中分别加入氨苄霉素、万古霉素、硫酸新霉素以及甲硝唑四种抗生素，给小鼠喂水一个月后清除肠道的共生菌群，将饮用正常水的小鼠作为其相应的对照，进行肝切除手术，通过观察小鼠的肝体比重、免疫组化的方法检测小鼠肝细胞增殖的速率来比较两种小鼠肝脏再生的能力。进一步给喂水一周、二周、三周、四周的小鼠分别进行肝切除以及检测结肠中细菌载量，来分析比较肠道共生菌群的载量与肝脏再生能力之间的关系，再分别将氨苄霉素、万古霉素、硫酸新霉素以及甲硝唑四种抗生素分别加入小鼠的饮用水中，探究何种抗生素敏感的共生菌群影响了肝脏再生的能力。通过比较抗菌素处理小鼠和对照小鼠在肝切除的不同时间点免疫系统细胞的比例和绝对数量来分析肠道共生菌群是通过影响免疫系统的亚群来调控肝脏再生的过程。
　　我们的研究结果发现口服抗生素清除肠道共生菌群后小鼠肝脏ALT、AST水平没有发生显著上调，也不会引起小肠和结肠的炎症发生，小鼠各个时间的肝体比重以及肝细胞的增长速率较对照组明显下调，随着抗生素喂水时间的延长，小鼠结肠中的细菌载量也相应的减少，伴随着小鼠肝脏再生能力的下降，在三周后稳定下来。进一步，我们分别将这四种抗生索加入到小鼠的饮用水中，观察单独一种抗生素对于小鼠肝脏再生能力的影响，结果发现氨苄霉素的处理相比于其它三种抗生素，对肝脏再生的抑制能力最强，暗示着氨苄霉索敏感的肠道共生菌群可以促进肝脏再生的过程。
　　对免疫学机制的研究发现，在抗生素喂水小鼠中肝切除的各个时间点，肝脏CD3+NK1.1+的NKT细胞比例、数量以及活化程度较正常饮用水小鼠相比显著增加，并且这群增加的NKT细胞是CDld依赖的，高表达趋化因子CXCR6且凋亡比例显著减少，在抗原刺激后活化性受体NKG2D，Fas，CD69的表达显著上调，抑制性受体NKG2A的表达上调，分泌细胞因子IFNγ的能力显著增强。抗生素喂水小鼠在CDld依赖的NKT细胞缺失或者阻断CDld分子的功能的时候肝细胞的增殖能力增强，而转输CDld依赖的NKT细胞会加重肝细胞增殖能力的减弱。T细胞以及NK细胞的清除小鼠中在抗生素口服处理后肝脏再生的能力无明显变化。
　　接下来我们研究发现，抗生索处理的小鼠中Kupffer细胞在肝脏中聚集、活化，并且Kupffer细胞在肝脏中的聚集是由于自身增殖能力增强而并非由外周血单个核细胞分化而来。Kupffer细胞表面活化性的标志CD80，CD86以及CD68的表达显著上调，TLR信号受体TLR2，TLR4的表达也明显上调。在体外LPS的刺激作用下，其分泌IL-6，TNFα，IL-10以及IL-12的能力显著增强，TLR3的激动剂polyl∶C可以明显回复抗生素处理小鼠肝脏再生的能力，而单次腹腔注射TLR2的激动剂Pamsck4以及TLR4的激动剂LPS显著减弱抗生素处理小鼠肝脏再生能力。接下来我们连续三天给小鼠腹腔注射低剂量的LPS模拟小鼠LPS耐受诱导模型，研究发现，LPS耐受模型可以显著下调抗生素处理小鼠Kupffer细胞表面CD80，CD86以及TLR受体的表达，而相应的肝脏再生的能力显著上调。
　　最后，我们在用脂质体体内清除Kupffer细胞，发现清除Kupffer细胞，肝切除12小时后，肝脏NKT细胞的活化性受体NKG2D，CD69和CD25的表达显著下调，分泌细胞因子IFNγ的能力减弱，同时我们在抗生素喂水小鼠肝切除前后的血清中检测到了IL-12表达的显著上调，IL-12p40缺陷的小鼠或者IL-12的中和抗体可以显著抑制肝脏中的NKT细胞的活化，进一步促进抗生素喂水小鼠肝实质细胞的增殖。
　　综上所述，我们可以推断肠道共生菌群是通过维持肝脏Kupffer细胞处于耐受稳态，防止NKT细胞的过度活化来促进肝脏再生的过程，我们的数据暗示着长时间抗生素的使用，会破坏肠道共生菌群，最后通过影响肝细胞再生过程来影响肝脏的功能。