TLR2参与HBV免疫耐受及HBV感染中记忆性NK细胞的研究

摘要

肝脏是人体非常独特的免疫器官，它对于接触到的大量的食物抗原常常诱导免疫耐受而非免疫应答。对这些无害抗原的耐受能使机体减少无谓的免疫反应，并能保护机体免于对外来抗原的免疫攻击而导致的肝脏炎症。然而肝脏免疫耐受的特性是一把双刃剑，在一些嗜肝病毒如乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)的感染下，肝脏常常不能很好地对其进行清除，使其在肝脏形成慢性感染并伴随肝脏炎症，而这是导致肝脏纤维化、肝硬化甚至肝癌的一个重要诱因。因此进一步对肝脏免疫耐受的机制进行研究并研究如何在慢性病毒感染的情况下打破肝脏免疫耐受是非常必要的。
　　CD8+T细胞对于清除HBV是至关重要的，然而在病毒慢性感染的情况下CD8+T细胞的功能通常处于一种耗竭的状态，高表达抑制性分子、低表达活化性分子，并且产生抗病毒细胞因子IFN-γ，TNF-α的能力也明显降低，从而导致其不能很好地发挥抗病毒的作用，使得病毒在机体中形成持续感染。多种细胞如调节性T细胞、γδT细胞、髓系来源的抑制性细胞(MDSC)被报道可以抑制CD8+T细胞的功能，而清除这些细胞亚群则可以增强CD8+T细胞的抗病毒功能并进而清除HBV。在本研究中深入探索了天然免疫的重要分子Toll样受体2(TLR2)在HBV介导的CD8+T细胞的耗竭中发挥的作用。
　　在病原体感染及被清除的过程中，会产生对该病原体特异性的记忆性细胞，而记忆性细胞在机体第二次遇到相同病原体的感染时能迅速扩增、发挥功能进而将该病原体清除。之前的研究一直认为具有记忆功能的细胞主要是获得性免疫系统的T、B细胞，而NK细胞则被认为是天然免疫的重要组成部分，它能在病原体感染的早期行使其杀伤功能，但一般不认为其具有记忆功能。但最近越来越多的研究表明，NK细胞也具有获得性免疫细胞的特性并且对于特定的抗原和病原体也有记忆性，同样能够保护机体免于相同病原体再次感染时所导致的死亡。因此，也关注在HBV被清除的过程中是否有记忆性NK细胞的产生并且它们是否能够保护机体免于后续慢性HBV感染导致的持续携带。
　　将从以下两个方面来描述本研究取得的实验结果:
　　Ⅰ.TLR2介导HBV持续携带导致的CD8+T细胞的耗竭
　　1.TLR2缺陷促进HBV的排斥
　　我们采用高压注射低剂量HBV质粒的模型来模拟HBV的持续携带，在该模型中，我们发现TLR2的缺陷能明显促进小鼠对HBV的排斥，而如果采用TLR2的激动剂使TLR2活化，则小鼠血清中HBV表面抗原的含量明显增高，表明TLR2活化会导致更为明显的HBV持续携带。
　　2.TLR2缺陷逆转HBV持续携带导致的CD8+T细胞的耗竭
　　在HBV持续携带的小鼠中，肝脏CD8+T细胞呈现出耗竭的状态。而在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中，肝脏CD8+T细胞的数目明显增多， HBV特异性的CD8+T细胞的比例明显上升，并且HBV特异性的CD8+T细胞表达PD-1的水平明显降低，另外，CD8+T细胞表达较多的活化性分子、较低的抑制性分子，产生抗病毒细胞因子IFN-γ，TNF-α的能力也是明显增强，更为重要的是TLR2-/-HBV-carrier小鼠中功能增强的CD8+T细胞在转输后能帮助受体鼠抵抗HBV的再次感染，也就证明了TLR2缺陷可以逆转HBV持续携带导致的CD8+T细胞功能的耗竭。
　　3.枯否细胞通过TLR2依赖的方式诱导CD8+T细胞的耗竭
　　进一步我们发现，HBV的注射可以明显上调枯否细胞表面TLR2的表达。并且与TLR2缺陷类似，枯否细胞的清除能够明显促进野生型小鼠对于HBV的排斥，而如果对野生型小鼠和TLR2-/-小鼠均进行枯否细胞的清除，可以发现原来存在于两组小鼠间的对HBV排斥能力的差异就消失了，提示我们表达在枯否细胞表面的TLR2在维持HBV持续携带的过程中发挥重要作用。另外，与在TLR2-/-HBV-carrier小鼠中观察到的现象类似，枯否细胞清除的HBV-carrier小鼠肝脏CD8+T细胞的功能也是明显增强的。因此，枯否细胞可以通过TLR2依赖的方式诱导HBV的持续携带和CD8+T细胞功能的耗竭。
　　4.HBV核心抗原(HBcAg)反应性的枯否细胞产生的白细胞介素10（IL-10）促进CD8+T细胞的耗竭
　　HBV质粒的注射可以使得枯否细胞向一种更具抑制性的状态转变，而且这种转变是依赖TLR2的。枯否细胞可以通过其表达的TLR2与HBV核心抗原相互作用产生更多的抑制性细胞因子IL-10，而IL-10可以直接抑制CD8+T细胞的功能。在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中，CD8+T细胞的功能得到增强，另外HBV特异性的CD8+T细胞的比例在IL-10-/-HBV-carrier小鼠中明显上调。并且HBV-carrier小鼠中枯否细胞产生的IL-10可以直接抑制CD8+T细胞产生IFN-γ的能力。因此，我们的结果就表明枯否细胞可以通过TLR2与HBV核心抗原的相互作用分泌更多的IL-10，进而抑制CD8+T细胞的功能。
　　结论Ⅰ:在HBV-carrier小鼠中，枯否细胞TLR2表达上调，并且在与HBV核心抗原相互作用后促进枯否细胞产生IL-10，而IL-10可以抑制CD8+T细胞的功能，导致HBV的持续携带。
　　Ⅱ.HBV清除模型中记忆性NK细胞的研究
　　1.HBV被清除的过程中NK细胞得到活化
　　我们采用高压注射高剂量HBV质粒的模型来模拟HBV的清除，发现在质粒注射后NK细胞的比例无明显变化，但其活化水平增强。
　　2.HBV质粒的注射促进NK细胞的增殖和记忆性分子的表达
　　我们发现HBV质粒注射后可以明显促进使得NK细胞先发生明显的增殖，而后增殖能力逐渐降低、恢复到原有水平。并且在HBV质粒注射后，NK细胞表面记忆性分子KLRG1的表达也是先明显的上调而后恢复到原有水平，与之前报道的记忆性NK细胞的表型一致。
　　3.转输HBV质粒致敏的淋巴细胞能保护受体鼠免于低剂量HBV质粒注射导致的HBV持续携带
　　我们给受体小鼠转输来自于高压注射高剂量HBV质粒小鼠的淋巴细胞后再对其进行高压注射低剂量HBV质粒，发现转输的细胞能帮助受体小鼠排斥HBV质粒。
　　4.转输HBV质粒致敏的NK细胞不能保护受体鼠免于低剂量HBV质粒注射导致的HBV持续携带
　　我们给受体小鼠转输来自于高压注射高剂量HBV质粒小鼠的NK细胞后再对其进行高压注射低剂量HBV质粒，发现转输的细胞不能帮助受体小鼠排斥HBV质粒。
　　结论Ⅱ:在HBV被清除的小鼠中存在记忆样的NK细胞，但将其转输后不能促进受体小鼠对于低剂量HBV质粒的排斥。