拟南芥转录因子bHLH34和bHLH104调控铁平衡

摘要

铁作为许多功能蛋白的重要辅助因子，对于植物的生长发育起着极其重要的作用。在人类中，缺铁是引起人类贫血症的主要原因之一，而植物性食物是人类获得铁的主要来源，因此研究植物体内铁的吸收，转运以及调控的机制是非常重要的。bHLH38/39/100/101是四个调控拟南芥缺铁响应的重要基因，但它们是如何被缺铁信号激活的还不清楚。为此，我们以bHLH101的启动子为诱饵进行酵母单杂交实验。通过筛选，我们鉴定到一个bHLH蛋白，bHLH34，它可以直接结合到bHLH101的启动子上。进一步分析发现，bHLH34的同源蛋白bHLH104也可以结合到bHLH101的启动子上。这暗示bHLH34和bHLH104可能也参与植物的缺铁响应调控。为了证实我们的推测，我们从拟南芥种质资源中心获得了bHLH34和bHLH104两个基因的T-DNA插入突变体，通过RT-PCR鉴定，两个突变体都是缺失突变体。考虑到bHLH34和bHLH104可能存在功能冗余性，我们又通过杂交构建了bhlh34bhlh104双突变体。表型分析发现，在缺铁条件下，bhlh34，bhlh104单突变体和bhlh34bhlh104双突变体都表现出了典型的缺铁症状，即叶子的黄化和根的生长抑制现象，其中bhlh34bhlh104双突变体的缺铁症状最为严重。为了进一步验证bHLH34和bHLH104的功能，我们设计了一个人工microRNA，amiR-bhlh34/104，它可以同时特异性的靶向bHLH34和bHLH104两个基因。我们构建了amiR-bhlh34/104转基因植株，发现转基因植株在缺铁条件下也表现出了典型的缺铁症状，其表型与bhlh34bhlh104双突变体类似，这说明amiR-bhlh34/104转基因植株模拟了bhlh34bhlh104双突变体的表型。
　　铁还原酶活性的升高是植物缺铁的一个典型指标，因此我们检测了野生型和突变体的铁还原酶活性。在缺铁条件下，野生型植株和突变体的铁还原酶活性都显著升高，但是突变体的铁还原酶活性远低于野生型，而且bhlh34bhlh104双突变体的铁还原酶活性最低。铁含量检测表明，无论在铁充足还是铁缺少的情况下，bhlh34bhlh104双突变体根和叶的铁含量都显著低于野生型。为了揭示bHLH34和bHLH104的分子调控机制，我们分析了缺铁响应基因的表达情况。铁吸收直接相关的两个基因IRT1和FRO2以及正调控植物缺铁响应的转录因子MYB10，MYB72，bHLH38/39/100/101和FIT在突变体中都下调。这说明bHLH34和bHLH104正调控缺铁响应。为了证实是否提高bHLH34和bHLH104的表达水平可以促进铁的吸收，我们构建了bHLH34和bHLH104的高表达转基因植株。大约10％的bHLH34高表达株系和33％的bHLH104高表达株系表现出植株矮小，老叶坏死的症状，而其余株系则没有明显表型。进一步分析发现，高表达株系积累了高水平的铁含量，并且大幅上调了缺铁响应基因的表达，这说明bHLH34和bHLH104的确是正调控缺铁响应的。
　　酵母单杂交实验表明bHLH101可能是bHLH34和bHLH104的直接靶基因。bHLH38/39/100是bHLH101的同源基因，并且它们都受到缺铁环境的强烈诱导，因此，我们猜测bHLH38/39/100/101可能都受到bHLH34和bHLH104的直接调控。为了证实该猜想，我们设计了一个effector-reporter瞬时表达系统。将b HLH38/39/100/101的启动子分别与含有核定位信号的GFP融合作为reporter，将bHLH34或bHLH104与CaMV35S启动子融合作为effector。瞬时共表达实验结果表明，bHLH34和bHLH104可以特异性地激活bHLH38/39/100/101的启动子，但不能激活FIT的启动子。这说明bHLH38/39/100/101都是bHLH34和bHLH104的靶基因。通过在bhlh34bhlh104双突变体的背景下高表达bHLH101，我们发现bhlh34bhlh104双突变体的缺铁症状得到了明显的缓解。基因表达分析发现，这些转基因植株中IRT1和FRO2的表达比bhlh34bhlh104双突变体显著提高，说明bHLH101的高表达可以部分互补bhlh34bhlh104双突变体的表型。
　　酵母双杂交实验，双分子荧光互补实验及免疫共沉淀实验同时证明了bHLH34和bHLH104可以互作形成异源二聚体。另外，我们又进一步通过酵母双杂交实验证实bHLH34，bHLH104和bHLH105任意两者之间都可以形成异源二聚体，它们也都可以与自身形成同源二聚体。为了进一步阐释这三个基因的关系，我们构建了两个双突变体bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105。我们发现bhlh34bhlh104，bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105三种双突变体的表型比bhlh34，bhlh104和bhlh105三种单突变体中任何一个的表型都更加严重，说明bHLH34，bHLH104和bHLH105这三个基因的功能是相互叠加的，而不是冗余的。此外，我们也观察到ProbHLH34:GUS，ProbHLH104:GUS和ProbHLH105:GUS在根和下胚轴具有不同的表达模式，这也许可以解释它们功能上的非冗余性。
　　我们的工作表明bHLH34和bHLH104转录因子通过介导bHLH38/39/100/101基因的转录从而正调控拟南芥的缺铁响应，并且增加bHLH34和bHLH104的表达水平足以提高植物的铁含量，这也为通过基因工程方法提高农作物的铁含量提供了一个新思路。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 植物bHLH转录因子的研究进展

1．1．1 植物bHLH转录因子的结构特点

1．1．2 植物bHLH转录因子的生物学功能

1．2 植物缺铁响应机制的研究进展

1．2．1 铁元素的吸收

1．2．2 铁元素的转运

1．2．3 植物缺铁响应的调控

1．2．4 调控缺铁响应的信号分子

1．2．5 铁的感知与信号传递

1．3 研究目的与研究内容

第2章 实验材料和方法

2．1 研究材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验菌株

2．2 主要试剂与配方

2．2．1 基因克隆与分离试剂

2．2．2 大肠杆菌细胞培养所用试剂

2．2．3 农杆菌细胞培养所需试剂和配方

2．2．4 突变体及转基因植株筛选所用试剂及配方

2．3 主要载体

2．4 主要研究方法

2．4．1 转基因表达载体的构建

2．4．2 质粒DNA转化大肠杆菌

2．4．3 Mini质粒DNA提取

2．4．4 农杆菌感受态细胞制备及转化

2．4．5 植物材料培养与处理

2．4．6 核酸提取

2．4．7 GUS检测

2．4．8 酵母实验

2．4．9 免疫共沉淀

2．4．10 叶绿素含量测定

2．4．11 铁的还原酶活性的测定

2．4．12 铁含量的测定

2．4．13 瞬时表达实验

第3章 实验结果

3．1 bHLH34和bHLH104的鉴定

3．2 bhlh34，bhlh104和bhlh34bhlh104突变体表现出缺铁症状

3．3 bhlh34，bhlh104和bhlh34bhlh104突变体中的缺铁响应过程被破坏

3．4 缺铁响应相关基因在bhlh34，bhlh104和bhlh34bhlh104突变体中的表达下调

3．5 bHLH34和bHLH104的高表达激活了植物的缺铁响应

3．6 bHLH34和bHLH104直接调控bHLH38／39／100／101的转录

3．7 高表达bHLH101部分互补了bhlh34bhlh104双突变体的表型

3．8 bHLH34与bHLH104互作

3．9 bHLH34，bHLH104和bHLH105之间的关系

第4章 讨论

参考文献

附录

致谢

在读期间完成的学术论文与取得的研究成果