基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲍曼不动杆菌及碳青霉烯类耐药基因的研究

摘要

目的：1.建立重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification RPA）15ul反应体系（本文中简称RPA-15ul反应体系）快速检测鲍曼不动杆菌的实时荧光检测方法，并同时进一步检测临床分离株，以评估该方法的临床实用性。2.选择鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因中检出率最高的blaOXA-23基因作为检测目的基因，建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测耐药基因的方法，以期检测细菌的同时完成耐药基因的测定，指导临床快速选择敏感抗生素。　　方法：1.分别根据鲍曼不动杆菌的鉴定基因blaOXA-51与16s-23s rRNA ITS基因的特异保守序列按照TwsitDX Inc公司提供的RPA引物与探针的设计原则设计一系列引物与探针，通过引物筛选，各选择一套最优的引物与探针分别进行特异性与灵敏性评价。以铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌四种非鲍曼不动杆菌作为阴性对照菌，采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR qPCR）和RPA-15ul反应体系作为核酸扩增技术，分别验证两种鉴定基因引物与探针的特异性；对菌液进行梯度稀释后提取模板，采用上述三种扩增技术分别验证两种鉴定基因的灵敏性，并比较三种方法灵敏性的差异以及两种鉴定基因灵敏性的不同；同时进一步采用PCR及RPA-15ul反应体系分别扩增两种鉴定基因检测30株鲍曼不动杆菌临床分离株，以验证RPA-15ul反应体系的实际应用性。2.以30株鲍曼不动杆菌临床分离株为研究对象，采用K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）检测30株临床分离株对19种抗生素的敏感情况；根据TwsitDX Inc公司提供的RPA引物与探针的设计原则设计鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的引物与探针，通过PCR和RPA-15ul反应体系扩增30株鲍曼不动杆菌临床分离株的目标DNA，评估两种检测方法的检出率，并结合药物敏感实验，分析鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素与耐药基因blaOXA-23基因之间的联系，同时评价RPA-15ul反应体系检测耐药基因的可行性。　　结果：1.本研究中RPA-15ul反应体系检测鲍曼不动杆菌的鉴定基因blaOXA-51基因与16s-23s rRNA ITS基因的灵敏性相当均为2.86CFU/ml,与PCR、qPCR灵敏性一致；三种检测方法中，两种鉴定基因的特异性均为100%。RPA-15ul反应体系分别扩增两种鉴定基因检测30株临床分离株，检出率均为100%，与PCR结果完全相符。2.K-B纸片琼脂扩散法检测30株鲍曼不动杆菌临床分离株的药物敏感实验结果如下：8/30(26.7%)株对米诺环素耐药，10/30(33.3%)株表现为中介，12/30(40.0%)株表现为敏感；17/30(56.7%)株对头孢哌酮/舒巴坦耐药，8/30(26.7%)株表现为中介，5/30(16.6%)株表现为敏感；27/30(97.0%)株对阿米卡星、美洛培南、亚胺培南耐药，3/30(10.0%)株表现为敏感；28/30(93.3%)株对萘替卡星、庆大霉素、头孢他啶、妥布霉素耐药，仅2/30(6.7%)株表现为敏感；29/30(96.7%)株对氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、四环素、头孢吡肟、头孢噻肟、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦耐药，仅1/30(3.3%)株表现为敏感；30/30(100%)株对复方新诺明耐药；30/30(100.0%)株临床分离株均表现为对多黏菌素B敏感。RPA-15ul反应体系扩增鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因，显示27/30(90%)株出现扩增信号，仅3/30（10%）株为阴性，与药物敏感实验结果对比发现未出现扩增的3株临床分离株均对美洛培南、亚胺培南敏感，即27株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii CRAB）中blaOXA-23耐药基因的检出率为100%,而3株碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌（Carbapenem-sensitive Acinetobacter baumannii CSAB）均未检出blaOXA-23耐药基因；RPA-15ul反应体系的结果与PCR扩增结果完全相符。　　结论：1.本研究建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测鲍曼不动杆菌的方法，两种鉴定基因blaOXA-51与16s-23s rRNA ITS基因均表现为灵敏性高，特异性高，检测快速，临床实用性强；RPA-15ul反应体系较标准50ul反应体系更为价廉，非常适合现场检测及偏远地区的推广。2.建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因，实现50min内完成细菌与耐药基因的快速检测；发现碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的检出情况与鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的耐药性一致。本研究实现鲍曼不动杆菌及耐碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的快速检测，有助于临床快速选择敏感抗生素，对减缓鲍曼不动杆菌耐药菌株的产生具有非常重要的意义。

目录

第一章 前言

1.1鲍曼不动杆菌概述

1.2 鲍曼不动杆菌耐药机制概述

1.3 病原菌及耐药性检测方法概述

1.3.1 病原菌的检测方法

1.3.2 病原体耐药性的检测方法

1.4 重组酶聚合酶扩增技术概述

第二章 重组酶聚合酶扩增技术快速鉴定鲍曼不动杆菌

第一部分 重组酶聚合酶扩增技术基于blaOXA-51基因鉴定鲍曼不动杆菌

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 重组酶聚合酶扩增技术基于16s-23s rRNA ITS基因鉴定鲍曼不动杆菌

材料与方法

结果

讨论

结论

第三章 重组酶聚合酶扩增技术快速检测碳青霉烯类耐药基因

材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验主要试剂

3.3 实验仪器

结果

1 鲍曼不动杆菌药物敏感实验

2 PCR检测碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因

3 RPA-15ul反应体系扩增碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因

讨论

结论

全文结论

参考文献

缩略词表

致谢

综述:重组酶聚合酶扩增技术的研究进展

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