UHRF1基因沉默对人肺腺癌A549细胞侵袭和迁移的影响及机制

摘要

目的：UHRF1(Ubiquitin-like with PHD and RING Finger domains1)是泛素样含PHD和环指域蛋白家族（UHRF）的主要成员之一，是调节肿瘤抑癌基因启动子区甲基化的重要表观遗传调节因子。UHRF1通过维持肿瘤抑制基因（tumor-suppressing gene，TSG）启动子区甲基化，抑制抑癌基因的表达，与肿瘤的发生、发展、治疗、预后等密切相关。目前尚无UHRF1基因沉默对人肺腺癌A549细胞侵袭和迁移的影响及机制的报道，本实验通过观察慢病毒介导的UHRF1基因沉默对人肺腺癌A549细胞侵袭和迁移能力的影响作用，并探讨其可能的调控机制，为非小细胞肺癌的治疗提供新的理论依据和方法。　　方法：将A549细胞接种于装有适量含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取处于对数生长期生长情况良好的细胞用于后续实验。转染前1d调整细胞密度为5×104/mL，以100μL/孔接种于96孔板。实验分为3组[未进行转染的空白对照组（NC组）、转染空病毒载体LV-NC-GFP的阴性对照组（空载组）及转染LV-UHRF1-shRNA-GFP#(39-1)的UHRF1干扰组（沉默组）]。采用Transwell实验在倒置显微镜下计数各组细胞迁移至微孔膜下层的细胞数，记录穿膜细胞数（个/HP）；采用细胞划痕实验观察0h、24h划痕宽度，记录24h划痕相对宽度；分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测各组细胞中的UHRF1、上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关分子（E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin）mRNA和蛋白表达水平；甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)检测细胞中KISS1和PAX5基因启动子区甲基化程度。上述所有实验均重复3次，取平均值。　　结果：1、慢病毒LV-UHRF1-shRNA-GFP#(39-1)转染A549细胞后显著沉默UHRF1mRNA及蛋白表达水平，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。2、细胞侵袭、迁移能力：UHRF1基因沉默后，沉默组穿膜细胞数明显少于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；UHRF1基因沉默后，24h划痕相对宽度明显大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。3、KISS1、PAX5甲基化程度：UHRF1基因沉默后，沉默组KISS1、PAX5基因启动子区甲基化程度明显降低，与对照组相比差异有统计学意义（P均＜0.01）。4、EMT相关分子的表达：UHRF1基因沉默后，沉默组细胞中N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达减少，E-Cadherin mRNA和蛋白表达增加，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。　　结论：1、慢病毒介导的shRNA沉默UHRF1基因表达，可抑制A549细胞侵袭和迁移能力。2、沉默UHRF1基因可降低A549细胞中KISS1、PAX5基因启动子区甲基化程度，抑制上皮间质转化（EMT）过程。3、沉默UHRF1基因表达可抑制A549细胞侵袭和迁移能力，其机制可能与降低KISS1和PAX5基因启动子区的甲基化程度，从而抑制上皮间质转化过程有关。

目录

前言

材料与方法

1 实验细胞

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 主要实验试剂配置

4.1完全细胞培养液

4.5MSP-PCR凝胶配制

5 实验方法

5.1人肺腺癌A549的复苏、培养

5.2人肺腺癌A549的传代

5.3慢病毒感染预实验

5.4慢病毒筛选

5.5 Western blotting法检测感染后A549细胞中UHRF1 蛋白的表达水平

5.6 Transwell实验检测感染后A549 细胞的侵袭能力

5.7细胞划痕实验检测感染后A549细胞的迁移能力

5.8感染后A549细胞中KISS1和PAX5基因启动子区甲基化程度检测

5.9 感染后A549细胞中EMT相关分子基因检测

5.10 感染后A549细胞中EMT相关分子蛋白检测

5.11技术路线

5.12统计分析

结果

1 慢病毒感染A549细胞后可抑制UHRF1 mRNA和蛋白的表达

2 UHRF1沉默后各组细胞侵袭、迁移能力比较

3 UHRF1沉默对KISS1和PAX5基因启动子区甲基化程度的影响

4 UHRF1沉默对EMT相关分子mRNA和蛋白表达的影响

讨论

1 UHRF1沉默对肺癌侵袭、迁移的抑制作用

2 KISS1、PAX5甲基化与肺癌的关系

3 上皮间质转化与肺癌的关系

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

综述:UHRF1与非小细胞肺癌关系的研究进展

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