瘫痪脊髓提取液对新生大鼠脑神经干细胞增殖影响的体外实验研究

摘要

目的：探讨不同时间点的瘫痪大鼠脊髓提取液对新生大鼠脑神经干细胞(NSC)增殖分化的影响。　　方法：(1)新生大鼠脑神经干细胞的取材、分离、培养、鉴定、传代培养至第五代，备用。(2)将15只健康的雌性成年SD大鼠分成三组，每组5只：瘫痪组用WD法制作T9平面完全性截瘫的SD大鼠脊髓损伤模型，假手术组在相同节段仅做椎板开窗，正常组不做处理，造模8、24、72h，5、7、14d后制备各组脊髓提取液。(3)将传至第5代的新生鼠脑神经干细胞分为9个组培养：A组-空白对照组（即培养基中加入PBS液共同培养），B组-正常组（即培养基中加入正常脊髓提取液共同培养），C组-假手术组（即培养基中加入假手术脊髓提取液共同培养），D组-瘫痪1组（即培养基中加入8h瘫痪脊髓提取液共同培养），E组-瘫痪2组（即培养基中加入24h瘫痪脊髓提取液共同培养），F组-瘫痪3组（即培养基中加入72h瘫痪脊髓提取液共同培养），G组-瘫痪4组（即培养基中加入5d瘫痪脊髓提取液共同培养），H组-瘫痪5组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养），I组-瘫痪6组（即培养基中加入14d瘫痪脊髓提取液共同培养）。(4)共同培养1、2、3、4、5d，用噻唑蓝(MTT)比色法检测每个高倍镜下NSC的数目来反映不同瘫痪脊髓提取液对NSC增殖能力的影响;共同培养24、48h，提取细胞总RNA，逆转录-多聚酶联反应(RT-PCR)检测Notch1、Hes1的表达。　　结果：(1)新生SD大鼠（2-3d内）脑源性细胞在体外可以大量扩增、形成球状团聚物，而且可以连续的、稳定的传代，培养到第5代的细胞Nestin免疫荧光染色(+)。(2)培养后1d各组神经干细胞的MTT值，A组为0.1317±0.0250，B组为0.1424±0.0331，C组为0.1487±0.0303，D组为0.1939±0.1613，E组为0.1839±0.1513，F组为0.887±0.115，G组为0.937±0.145，H组为0.2139±0.1733，I组为0.1899±0.1589;其中H组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05);第2d各组MTT值：A组为0.1860±0.0187，B组为0.1813±0.0324，C组为0.1955±0.0311，D组为1.213±0.025，E组为1.287±0.031，F组为0.2287±0.0313，G组为1.403±0.025，H组为0.2864±0.0253，I组为1.313±0.025，H组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05);第3d各组MTT值：A组为0.2378±0.0288，B组为0.2452±0.0310，C组为0.2276±0.0273，D组为0.2911±0.3306，E组为0.2951±0.3106，F组为0.2851±0.3106，G组为0.3116±0.3376，H组为0.3217±0.3276，I组为0.2811±0.2913，H组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05);第4d各组MTT值：A组为0.2865±0.0238，B组为0.2806±0.0337，C组为0.3070±0.0197，D组为0.3533±0.0274，E组为0.3733±0.0284，F组为0.3633±0.0287，G组为0.3733±0.0268，H组为0.3812±0.0297，I组为0.3511±0.0274，H组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05);第5d各组MTT值：A组为0.3224±0.0175，B组为0.3094±0.0273，C组为0.3149±0.0173，D组为0.3831±0.0166，E组为0.3931±0.0216，F组为0.3911±0.0197，G组为0.4331±0.0182，H组为0.4376±0.0232，I组为0.3831±0.0147，H组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05)。A、B、C组之间每个高倍镜下在各时间点的细胞MTT值没有明显差异(P＞0.05)。各个瘫痪组的MTT值均显著高于A、B、C组(P＜0.05)，其中瘫痪组中瘫痪5组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）各时间段点细胞MTT值显著增高，高于其他8组(P＜0.05)。(3)各组24hNotch1mRNA的表达：A组为1.003±0.099，B组为1.175±0.162，C组为1.076±0.212，D组为1.312±0.333，E组为1.879±0.148，F组为2.325±0.427，G组为2.712±0.183，H组为3.800±0.495，I组为3.107±0.278;各组48hNotch1mRNA的表达A组为1.003±0.099，B组为1.203±0.170，C组为1.063±0.067，D组为1.629±0.249，E组为2.108±0.136，F组为3.035±0.128，G组为4.132±0.574，H组为7.217±0.279，I组为4.191±0.291。各组24hHes1mRNA的表达A组为1.016±0.212，B组为1.146±0.213，C组为1.156±0.352，D组为1.540±0.386，E组为1.875±0.084，F组为2.207±0.199，G组为3.960±0.569，H组为4.659±0.422，Ⅰ组为3.602±0.495;各组48hHes1mRNA的表达情况：A组为1.010±0.176，B组为1.177±0.119，C组为1.282±0.462，D组为2.213±0.756，E组为2.735±0.599，F组为3.725±0.294，G组为5.302±1.192，H组为7.675±0.838，I组为6，302±0.637，整个瘫痪组24h和48h的Notch1、Hes1mRNA的表达比A、B、C三组强(P＜0.05)，而A、B、C组24h和48h的Notch1、Hes1mRNA的表达基本没有明显的差异(P＞0.05)。在瘫痪组中，H组-瘫痪5组（即培养基中加入7d瘫痪脊髓提取液共同培养）在各个时间点的Notch1、Hes1mRNA的表达明显高于其他8组(P＜0.05)。　　结论：(1)新生SD大鼠脑神经干细胞不仅具有扩增、分化成多类神经细胞的能力，表达原始神经细胞的表面标记物Nestin，符合NSC的判定。(2)瘫痪脊髓提取液可以上调神经干细胞Notch1和Hes1mRNA的表达水平、促进NSC的增殖，可模拟SCI后的微环境。(3)SCI后，7d的脊髓提取液促进大鼠脑NSC的增殖以及Notch1和Hes1mRNA的作用最强，且随共培养的时间增加而增加，因此推测在脊髓损伤的第7d封闭Notch信号可能是促进内源性NSC增殖的最佳时机。

目录

摘要

前言

1．材料和实验方法

1．1 实验动物

1．2 主要试剂和产地

1．3 主要仪器设备和产地

2．实验步骤

2．1 神经干细胞原代培养、传代

2．2 制备脊髓提取液

2．3 大鼠脊髓组织行HE染色观察组织变化情况

2．4 神经干细胞和各组脊髓提取液共同体外培养

2．5 统计学处理

3．结果

3．1．新生大鼠脑源性NSC的一般生长情况及鉴定

3．2．大鼠脊髓组织HE染色

3．3 脊髓提取液对神经干细胞生长曲线的影响

3．4 MTT试验对各组神经干细胞增殖能力检测的结果

3．5 神经干细胞内Notch1及Hes1 mRNA的RT-PCR检测结果

4．讨论

4．1 内源性神经干细胞修复脊髓损伤的现状

4．2 不同时间点的瘫痪脊髓液对于神经干细胞增殖的影响

5．结论

参考文献

致谢

大鼠脊髓损伤模型的制备及选择 综述

声明