PCL-PEI纳米粒子介导的CXCL10基因治疗对放疗杀伤宫颈癌细胞作用影响的体外研究

摘要

目的:宫颈癌(Cervical cancer)是一种起源于宫颈的恶性肿瘤。它是一种常见的恶性肿瘤，是世界上主要的恶性肿瘤之一。本实验的研究目的在于初步探讨PCL-PEI(Polycaprolactone-Polyethylenimine，聚己内酯-聚乙烯亚胺，PEA)介导的趋化因子CXCL10(Chemokine CXCL10)基因治疗对放疗杀伤宫颈癌细胞作用的影响。　　方法:利用PEI(1.8kDa)和PCL通过迈克尔加成反应成功地合成了聚合物PCL-PEI，并用1H-核磁共振对聚合物的结构进行了分析。使用激光粒度分析仪检测PCL-PEI纳米粒子的Zeta电位及粒径。使用透射电镜观察PCL-PEI纳米粒子以及PCL-PEI与CXCL10质粒缩合后的纳米复合物的形貌。通过MTT实验检测PCL-PEI纳米粒子的细胞毒性。在证实成功地合成了聚合物后，使用PCL-PEI纳米粒子与绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)制备了PCL-PEI+pEGFP纳米复合物，通过琼脂糖凝胶电泳实验得到纳米粒子与质粒缩合的最优质量比。接下来，按照最优质量比制备PCL-PEI+pEGFP纳米复合物，通过倒置荧光显微镜观察该复合物转染Hela细胞后绿色荧光蛋白质表达情况。随后使用PCL-PEI+pCXCL10纳米复合物转染Hela细胞，通过PCR实验扩增CXCL10目标基因片段，琼脂电泳实验证实转染成功。最后，实验将Hela细胞分成四组进行处理，分别为空白对照+放疗组，PCL-PEI+放疗组，PCL-PEI+pPUC4.1（空质粒）+放疗组，PCL-PEI+pCXCL10+放疗组，待细胞转染24小时后行6Gy放疗，放疗48h后利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，放疗4小时内行克隆形成实验测定各组的克隆形成能力。结果:成功地合成了可降解聚合物PCL-PEI，其能在PBS溶液中形成纳米粒子，1H-核磁共振对聚合物的结构进行了分析，利用透射电镜对聚合物进行了形貌分析，证实其结构与目标产物结构一致。激光粒度分析仪测得PCL-PEI的Zeta电位及粒径分别为:+15mV，213nm。琼脂糖凝胶电泳实验测得PCL-PEI纳米粒子缩合质粒DNA的最优质量比为1∶1。MTT实验表明，聚合物的毒性较小，在工作浓度时几乎没有表现出细胞毒性。倒置荧光显微镜观察到经PCL-PEI+pEGFP纳米复合物转染的Hela细胞成功地表达了绿色荧光蛋白。PCR-琼脂凝胶电泳实验证实了PCL-PEI+pCXCL10纳米复合物成功地转染了Hela细胞。最后，流式细胞学证实PCL-PEI+pCXCL10+放疗组的凋亡率明显提高，克隆形成实验证实该组的克隆形成能力更弱。结论:1.成功地合成了聚合物PCL-PEI，其细胞毒性较低，细胞毒性与浓度呈正相关，而在工作浓度时几乎没有表现出细胞毒性，是一种安全低毒的基因载体。2.PCL-PEI聚合物能在PBS中形成纳米粒子，纳米粒子表面带正电荷，粒径分布均匀。3.PCL-PEI纳米粒子能缩合质粒DNA，并能转染细胞，在细胞中表达。4.初步证实成功表达了CXCL10的Hela细胞凋亡率更高，克隆形成能力更弱，表明PCL-PEI纳米粒子介导CXCL10基因治疗可提高放疗对Hela细胞的杀伤作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

结果

1 PCI-PEI聚合物的合成与表征

2 纳米材料的理化性质及形貌

3 DNA凝胶阻滞实验

4 PCL-PEI的体外细胞毒性试验

5 体外基因转染

6 PCR反应

7 流式细胞学实验

8 克隆形成实验

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

趋化因子CXCL10在恶性肿瘤发生发展中的研究进展 综述

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