组织工程椎间盘构建及体内生物学功能初步评价

摘要

目的：模拟椎间盘组织结构和功能，构建具有生物学活性的组织工程椎间盘，初步评价其在体内的生物学功能。　　方法：⑴取3周龄新西兰大白兔椎间盘组织，利用Ⅱ型胶原酶消化法分别获取髓核细胞和纤维环细胞，观察鉴定第二代(P2)细胞。⑵利用交联反应制备的壳聚糖水凝胶作为髓核支架，利用静电纺丝技术制备的聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯[poly(butylenesuccinate-co-terephthalate)，PBST]纺丝薄膜作为内纤维环支架，以实心的PBST环作为外纤维环支架。采用扫描电镜表征壳聚糖水凝胶和PBST纺丝薄膜的空间结构，测试PBST纺丝薄膜的孔隙率及吸水率。⑶在壳聚糖水凝胶、PBST纺丝薄膜上分别接种髓核细胞和纤维环细胞，培养3W后，HE染色检测支架的细胞相容性。⑷以壳聚糖水凝胶作为髓核支架，PBST纺丝薄膜作为内纤维环支架，实心的PBST环作为外纤维环支架，组装成PBST/壳聚糖水凝胶三相组织工程椎间盘支架，检测三相组织工程椎间盘支架的力学性能。⑸将P2代纤维环细胞、髓核细胞分别接种在纤维环、髓核支架上，再移至裸鼠皮下培养;4W后，通过HE、番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色观察组织工程椎间盘的形态结构和Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。⑹用上述裸鼠皮下培养的组织工程椎间盘置换3月龄新西兰大白兔的椎间盘，钢板固定相邻椎体。术后4W行X线、MRI检测并获取组织工程椎间盘标本，通过HE、番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色观察组织工程椎间盘的形态结构和Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。⑺提取裸鼠皮下组织工程椎间盘（裸鼠组）、实验兔体内组织工程椎间盘（实验兔组）、兔正常椎间盘（对照组）的RNA，体外扩增CollagenⅡ、Aggrecan基因，RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖的表达。　　结果：①体外培养的P2代纤维环细胞、髓核细胞在形态上呈长梭形或多边形，生长速度快。两种细胞的番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan(蛋白聚糖)免疫荧光染色均呈阳性，表明细胞分泌Ⅱ型胶原、蛋白聚糖。②壳聚糖水凝胶呈白色海绵状，吸水后呈透明胶冻状，扫描电镜见支架存在大量孔隙，孔隙之间相互连通。接种髓核细胞体外培养3W后，HE染色可见细胞在支架内生长良好，细胞分布均匀。③光镜下见PBST纤维粗细均匀，无珠状体形成;PBST纺丝薄膜呈白色，较疏松，孔隙率为61.83％±7.33％，吸水率为297.34％±57.13％;复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜HE染色可见纤维环细胞在PBST纺丝薄膜内分布均匀，细胞大量增殖。④组装的三相组织工程椎间盘支架大小约9×5×2 mm，各相之间连接紧密，无明显缝隙;压缩强度为3.10MPa±0.13MPa，弹性模量为22.22 Mpa±0.92Mpa;拉伸强度为3.21MPa±0.18MPa，弹性模量为18.13MPa±1.30MPa。⑤裸鼠皮下构建的组织工程椎间盘具有与正常椎间盘相似的结构，各相之间融合良好，种子细胞在组织工程椎间盘内分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。⑥X线检测见钢板内固定位置良好，无断裂、移位，椎间隙高度正常;MRI检测见组织工程椎间盘T2相为高信号。⑦术后4W解剖实验兔，组织工程椎间盘在椎间隙位置良好，形态完整，无移位、碎裂;组织工程椎间盘的HE染色见大量细胞，番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色阳性，表明组织工程椎间盘含有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。⑧RT-PCR: CollagenⅡ mRNA的表达:对照组高于实验兔组，P=0.001，差异具有统计学意义;对照组高于裸鼠组，P=0.000，差异具有统计学意义。Aggrecan mRNA的表达:对照组高于实验兔组，P=0.000，差异具有统计学意义;对照组高于裸鼠组，P=0.000，差异具有统计学意义;裸鼠组高于实验兔组，P=0.000，差异具有统计学意义。　　结论：⑴PBST/壳聚糖三相组织工程椎间盘支架材料符合正常椎间盘的结构特点，具有良好的细胞相容性、孔隙率、力学性能和可塑性。⑵在裸鼠皮下构建的组织工程椎间盘各相之间融合良好，形态学观察、组织结构特点与正常椎间盘相似，具有细胞生物活性。⑶采用钢板固定相邻上下椎体的固定方式可靠。组织工程椎间盘在体内继续保持细胞活性，分泌椎间盘细胞外基质，部分发挥椎间盘的生物学功能。⑷本实验可为组织工程椎间盘构建提供理论依据。

目录

摘要

前言

第一部分 组织工程椎间盘种子细胞的培养鉴定和支架材料的制备表征

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 组织工程椎间盘构建及体内生物学功能初步评价

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述：组织工程椎间盘纤维环：如何更接近于天然

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