瘦素通过调控T细胞平衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病中作用的研究

摘要

目的：探讨瘦素(leptin)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的促进作用及其对T细胞平衡的调控机制。　　方法：将45只健康雌性C57BL/6小鼠随机分为:正常对照组、EAE对照组、leptin处理组，每组15只。EAE对照组和leptin处理组采用MOG35-55加完全弗氏佐剂(CFA)诱导C57BL/6小鼠制作EAE模型，正常对照组给予注射等量的生理盐水和CFA。于造模当天和造模后48小时，分别将0.2ml百日咳毒素溶液（200ng/只）注入每只小鼠腹腔内。自造模当日起，leptin处理组每日两次（9点和18点）给予腹腔注射重组leptin（0.5μg/g），正常对照组及EAE对照组分别每日两次给予腹腔注射等量生理盐水，连续10天。EAE对照组、leptin处理组小鼠连续三天症状评分无加重、出现四肢瘫痪或死亡可作为发病的高峰期，在高峰期时处死小鼠，正常对照组及未发病小鼠饲养4周后处死，留取小鼠脑和脊髓组织、眶周静脉血、脾脏。指标检测：记录各组小鼠发病情况、高峰期的主要症状、潜伏期、进展期及高峰期神经功能障碍评分；HE染色观察小鼠脑和脊髓的病理改变，并对其进行评分；流式细胞仪检测小鼠脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17细胞占CD4+T细胞比例；ELISA法检测各组小鼠外周血血清IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1含量；对EAE对照组及leptin处理组各项指标进行相关性分析。　　结果：⑴各组小鼠发病情况、高峰期主要症状、潜伏期、进展期及高峰期神经功能障碍评分的变化:正常对照组未发病，EAE对照组有13只小鼠发病，leptin处理组全部发病;与EAE对照组比较，leptin处理组发病高峰期主要症状更重，潜伏期缩短(P＜0.01)，进展期延长(P＜0.01)，高峰期神经功能障碍评分增加(P＜0.05)。⑵各组小鼠脑和脊髓组织病理改变:正常对照组小鼠脑和脊髓无异常，EAE对照组及leptin处理组可见组织疏松肿胀，血管周围白质明显的脱髓鞘改变，血管周围尤其是小静脉的周围可见炎性细胞浸润，呈典型的“袖套”样改变;与EAE对照组比较，leptin处理组小鼠脑和脊髓组织病理评分增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）。⑶各组小鼠血清中IFN-γ、IL-4的含量及IFN-γ/IL-4比值变化:与正常对照组比较，EAE对照组、leptin处理组小鼠血清IFN-γ含量明显升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）;与EAE对照组比较，leptin处理组小鼠血清IFN-γ含量明显升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）。⑷各组小鼠血清中IL-17、TGF-β1的含量变化:与正常对照组比较，EAE对照组、leptin处理组小鼠血清IL-17含量均升高，TGF-β1含量均明显降低，差异均具有统计学意义(P均＜0.01);与EAE对照组比较，leptin处理组小鼠血清IL-17含量升高，TGF-β1含量明显降低，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）。⑸各组小鼠脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17细胞占CD4+T细胞比例的变化:与正常对照组比较，EAE对照组、leptin处理组小鼠脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例均明显降低，Th17细胞比例均升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）;与EAE对照组比较，leptin处理组小鼠脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例降低，Th17细胞比例升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）。⑹相关性分析：EAE对照组和leptin处理组小鼠发病潜伏期与血清IL-4、TGF-β1的含量、脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例呈正相关(P均＜0.01);与血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾细胞悬液中Th17比例呈负相关（P均＜0.01）；EAE对照组和leptin处理组小鼠发病进展期与血清IL-4、TGF-β1的含量、脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例呈负相关（P均＜0.01）;与血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾细胞悬液中Th17比例呈正相关（P均＜0.01）；EAE对照组和leptin处理组小鼠发病高峰期神经功能障碍评分与血清IL-4、TGF-β1的含量、脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例呈负相关（P均＜0.01）;与血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾细胞悬液中Th17比例呈正相关（P均＜0.01）；EAE对照组和leptin处理组小鼠脑和脊髓组织病理评分与血清IL-4、TGF-β1的含量、脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例呈负相关（P均＜0.01）;与血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾细胞悬液中Th17比例呈正相关（P均＜0.01）。　　结论：①采用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型，EAE小鼠的神经功能障碍明显，脑和脊髓病理切片可见血管周围明显炎性细胞浸润及白质脱髓鞘改变，说明造模成功。②EAE小鼠体内存在着T细胞平衡紊乱。EAE小鼠发病高峰期血清中IFN-γ及IL-17含量升高，IL-4、TGF-p1含量降低，脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例下降，Th17细胞比例升高，说明EAE内存在Th1/Th2平衡及Th17/Treg平衡漂移。③Leptin可以缩短EAE小鼠发病潜伏期、延长进展期、增加神经功能障碍评分、加重脑和脊髓组织的炎性细胞浸润，说明leptin具有促进EAE小鼠发病的作用。④Leptin能促进EAE小鼠中Th1和Th17的分化，促进炎性因子IFN-γ和IL-17的表达，抑制Th2和CD4+CD25+Foxp3+Treg的分化，抑制抑炎因子IL-4、TGF-β1的分泌，使Th1/Th2细胞平衡向Th1漂移，Th17/Treg细胞平衡向Th17漂移，加重EAE的炎症反应。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 取材

4 指标检测及方法

5 统计学的处理

结果

1 正常对照组、EAE对照组及leptin处理组小鼠发病情况

2 正常对照组、EAE对照蛆及leptin处理组小鼠脑脊髓病理学改变

3 正常对照组、EAE对照组及leptin处理组小鼠血清IFN-γ、IL-4的含量及IFN-γ／IL-4比值

4 正常对照组、EAE对照组及lemin处理组小鼠血清IL-17、TGF-β1的含量

5 正常对照组、EAE对照组及leptin处理组小鼠脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+Treg及Thl7细胞占CD4+T细胞的比例

6 相关性分析

讨论

1 EAE模型的建立与评价

2 T细胞平衡与EAE

3 Leptin对EAE发病的促进作用

4 Leptin对EAE中T细胞平衡的影响

5 展望

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

附图

致谢

神经胶质细胞在多发性硬化中的作用 综述

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