EphrinBs/EphBs信号通路通过Calpain-1和Caspase-3参与脊髓伤害性疼痛过程的机制研究

摘要

研究目的：　　自古至今疼痛都是医学界的一大难题，同时亦是临床中急需解决的问题之一。疼痛按照不同特性可分为炎性痛、神经病理性疼痛等。虽然分类比较明确，但疼痛的具体机制及有效治疗手段目前仍然没有明确指南。近些年以来有较多研究表明ephrins及其受体Ephs，即受体酪氨酸激酶(RTKs)亚家族在中枢神经系统的多个方面如突触重塑及组织重塑性等环节发挥作用。Eph受体的功能多样性源于其与配体ephrin通过跨细胞膜的受体配体结合作用形成复杂信号通路广泛参与组织的形成过程，尤其是树突、棘突的发育和完善等方面，从而在脊髓伤害感受性疼痛中发挥其不可替代的作用。这种作用主要作用于谷氨酸兴奋性突触后电位，不仅参与树突棘突细胞骨架的形成，而且参与谷氨酸受体在突触可塑性过程中的运输。另外，EphB受体也被研究证实与阿尔茨海默病(AD)等神经系统疾病相关，因此可能会成为临床干预性治疗的新目标。在伤害感受性疼痛的发生发展过程中，除ephrin/eph信号通路参与外，还同时存在大量钙蛋白(calpain)的活化，研究证实活化的calpain启动Ca2+大量内流进而促进骨架蛋白和细胞膜蛋白等降解，影响calpain的磷酸化从而参与神经病理性过程及突触重塑性的调整。综上所述，提出如下假设:ephrin/eph信号通路通过调节脊髓中calpain的变化参与突触可塑性的改变从而调节脊髓伤害性疼痛过程。　　本课题拟通过动物行为学研究及相关分子检测等技术，观察鞘内注射受体酪氨酸激酶亚家族EphB1及其配体ephrinB2-Fc（Fc标签）对小鼠脊髓疼痛行为的作用及其对calpain-1表达水平的影响，探索ephinB/EphB信号通路是否可通过calpain-1及其下游分子的相互作用参与脊髓伤害性疼痛的过程。　　研究方法：　　1、雄性昆明小鼠随机分为两部分，一部分通过鞘内注射ephrinBs配体方式建立小鼠脊髓伤害性疼痛模型，剩余部分通过给坐骨神经慢性压榨损伤(Chronic constriction injury，CCI)模型小鼠鞘内注射EphBs受体建立疼痛逆转模型。利用机械痛阈值及热痛阈值测定的方法测定两组不同模型小鼠行为学改变情况。行为学测定期间，取部分小鼠脊髓L5-6腰膨大部位，利用westernblot(WB)及免疫组化(IHC)等技术观察并测定脊髓中calpain-1和caspase-3的表达变化。　　2、给予小鼠鞘内先后注射ephrinBs及calpain-1特异性抑制剂MDL28170，根据注射顺序不同分为MDL28170预处理组及MDL28170后处理组。通过测定小鼠机械痛阈值及热痛阈值观察两组小鼠行为学变化，进一步通过WB及IHC技术分别检测小鼠行为学变化过程中出现的calpain-1，caspase-3的表达变化。　　3、通过鞘内注射ephrinBs配体方式建立小鼠脊髓伤害性疼痛模型，行为学测定确认模型成功，取小鼠脊链组织，利用免疫荧光技术检测calpain-1及caspase-3的表达定位。　　研究结果：　　1、通过第一部分实验发现:鞘内给予ephrinB2-Fc注射可使小鼠产生一个时间及注射剂量相关性机械痛敏反应和热痛敏反应及脊髓calpain-1和caspase-3的表达升高(P＜0.001);注射配体ephrinB1-Fc仅出现明显的机械痛敏，热性异常痛不明显(P＜0.01)。而与Saline组相比，鞘内注射EphB2-Fc可显著减轻CCI小鼠产生的疼痛反应(P＜0.05)。　　2、通过第二部分实验发现:给予MDL28170预处理及后处理均可逆转因注射ephrinB2-Fc产生的机械痛敏和热痛敏反应，并降低脊髓内calpain-1和caspase-3的表达(P＜0.01)。　　3、免疫荧光共标染色结果表明:calpain-1及caspase-3均与NeuN（神经元标记物）共表达而非GFAP（星形胶质细胞标记物）和Iba-1（小突胶质细胞标记物）。　　研究结论：　　本研究可得出如下结论:　　1、受体酪氨酸激酶中ephrinBs/EphBs亚家族参与脊髓伤害性疼痛过程的产生。其中配体ephrinBs鞘内注射可使小鼠产生一个时间和剂量依赖性变化的机械痛和热痛;受体EphBs鞘内注射可以减轻甚至逆转CCI小鼠的疼痛反应。　　2、ephrinBs/EphBs参与脊髓伤害疼痛的过程主要通过调节脊髓中calpain-1和caspase-3的表达变化实现。ephrinBs鞘内注射使小鼠产生的机械痛和热痛该反应与脊髓calpain-1及caspase-3表达增高直接相关，该增高现象可被calpain-1的特异性抑制剂——MDL28170而拮抗，同时使得脊髓中caspase-3的表达下降。　　3、免疫荧光共染结果显示calpain-1及caspase-3均只与NeuN（神经元标记物）共表达，说明其机制可能与调节神经元上的calpain-1和caspase-3表达变化有关。ephrinBs/EphBs信号通路主要通过作用于脊髓神经元中的calpain-1/caspase-3环路参与脊髓伤害性疼痛过程的发生与发展。

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摘要

论文缩略词一览表

前言

第一部分 ephrinBs／EphBs信号通路对于小鼠脊髓伤害性疼痛行为学影响及脊髓calpain-1表达的研究

材料和方法

结果

结论

讨论

第二部分 ephrinBs／EphBs信号通路通过calpain-1／caspase-3环路影响小鼠脊髓伤害性疼痛过程

材料和方法

结果

结论

讨论

第三部分 Calpain-1和caspase-3在脊髓疼痛过程中的细胞定位

材料和方法

结果

结论

讨论

全文小结

参考文献

综述

在读期间发表论文和科研情况汇总

致谢