lncRNA NR_120420早期诊断急性脑梗死及促进其凋亡的机制研究

摘要

本研究的主要目的有二：1、研究外周血差异表达的lncRNAs作为急性脑梗死生物标志物的诊断价值;2、研究神经细胞中差异表达的lncRNAs调控缺血损伤后凋亡的机制。　　本研究涉及的主要技术方法有：外周全血及贴壁细胞总RNA的抽提，lncRNAs芯片，生物信息学分析技术，定量PCR，贴壁细胞培养、传代与OGD模型建立，贴壁细胞转染siRNAs，CCK8细胞活力检测，TUNEL细胞凋亡检测，流式细胞术，Western blotting（蛋白质免疫印迹实验），医学统计学。　　第一部分 急性脑梗死后循环血lncRNAs的芯片差异表达谱及生物信息学分析　　目的：建立急性脑梗死患者与健康志愿者的外周全血lncRNAs与mRNAs差异表达谱，分析差异表达的lncRNAs涉及的功能、通路及转录因子。　　方法：分别采集6例急性脑梗死患者及3例健康志愿者的外周全血，以PAXgene Blood miRNA Kit提取总RNA，按Agilent Human lncRNA Microarray4*180K V5芯片的标准流程进行质控、标记、杂交、扫描、原始信号提取、数据标准化。将p≤0.05，倍数改变值≥2.0者定义为差异lncRNAs。取倍数改变值排在前400位的lncRNAs与芯片的完整mRNAs数据库进行共表达分析，然后进行功能预测、通路预测及其与转录因子的关联分析。　　结果：1、脑梗死患者与健康志愿者对比共检测出差异mRNAs1990种，其中上调的有1468种，下调的有522种;共检测出差异lncRNAs5686种，其中上调的有4641种，下调的有1045种。2、GO分析显示与急性脑梗死差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等生物功能。3、基于KEGG数据库的Pathway分析显示与急性脑梗死差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及凋亡、神经营养因子信号通路等。4、与急性脑梗死的差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及PBX3、STAT1等转录因子。　　结论：芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lncRNAs表达谱，其探针的阈值可以胜任全血lncRNAs的检测。其差异mRNAs和lncRNAs以上调者居多。后续的GO分析显示异常表达的lncRNAs涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等功能，Pathway分析显示他们与凋亡有密切关系。转录因子关联分析的数据可以促进lncRNAs转录调节的研究。　　第二部分 循环血lncRNAs早期诊断急性脑梗死的价值及其与分型、预后的关系　　目的：1、以定量PCR验证芯片全血lncRNAs差异表达谱的可靠性;2、进一步探讨lncRNAs标志物是否是急性脑梗死的独立诊断因子;3、研究lncRNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、研究lncRNAs标志物的表达与脑梗死分型及预后的关系。　　方法：1、选择芯片全血lncRNAs芯片差异表达谱的部分lncRNAs，以另外39名急性脑梗死患者及39名健康志愿者的标本以定量PCR检测其表达差异;2、以二分类logistic回归分析来研究差异lncRNAs与脑梗死状态的相关性;3、使用ROC曲线来判断候选lncRNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、比较候选lncRNAs标志物的表达水平在不同OCSP分型的脑梗死患者与健康志愿者之间的差异，比较候选lncRNAs在3个月随访的MRS高评分组与低评分组之间的差异。　　结果：1、从芯片差异谱中挑选9种lncRNAs以定量PCR验证其差异，其中6种lncRNAs在芯片中是表达增高的;3种在芯片中是表达降低的。定量PCR的结果显示脑梗死患者的这9种lncRNAs的表达全部都是增高的，其中NR_120420和lnc-GCH1-2∶3有统计差异，其余7种lncRNAs无统计差异;2、对所有的临床特征、NR_120420及lnc-GCH1-2∶3的表达水平进行logistic回归分析，NR_120420、年龄及高脂血症进入回归模型，lnc-GCH1-2∶3未进入回归模型，NR_120420有统计学意义;3、NR_120420诊断完全前循环型(TACI)脑梗死的AUC是0.861，灵敏度和特异度分别是85.7％和84.6％,lnc-GCH1-2∶3诊断TACI型脑梗死的AUC是0.802，灵敏度和特异度分别是85.7％和特异度82.1％;4、TACI型脑梗死患者的NR_120420及lnc-GCH1-2∶3表达水平较健康志愿者显著升高，预后不佳组(MRS3-6)的NR_120420及lnc-GCH1-2∶3表达水平较预后良好组(MRS0-2)显著升高。　　结论：定量PCR与芯片的结果总体变化趋势一致，NR_120420和lnc-GCH1-2∶3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异。Logistic回归分析显示NR_120420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lncRNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度，二者在外周全血中的表达与脑梗死患者的OCSP分型及预后有相关性。　　第三部分 lncRNA NR_120420促进神经细胞缺血损伤后凋亡的机制　　目的：1、检测来自第二部分研究的两种lncRNAs在神经细胞的OGD模型中是否发生相应变化，同时选择具体的造模方式及工具siRNAs;2、研究两种目标lncRNAs是否调控本模型的凋亡;3、研究敲低目标lncRNAs后模型中靶因子的变化;4、证实敲低目标lncRNAs后模型凋亡的变化与靶因子的变化是否存在因果关系。　　方法：1、分别以OGD0、4、8、12h及OGD4、8、12h后再灌注24h这7种方式处理SH-SY5Y细胞后，以定量PCR检测目标lncRNAs的变化，分别以设计的6种siRNAs转染细胞后以定量PCR检测相应lncRNAs的变化;2、对细胞转染敲低效率合格的4种siRNAs后，给予OGD8h建立细胞模型，再分别以CCK8法检测细胞活力，以TUNEL法及流式细胞术(AnnexinⅤ-FITC/PI)检测细胞的凋亡;3、敲低本模型中的NR_120420后分别以western检测p-P65、P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT在蛋白水平的变化;4、对细胞转染siNR_120420后分别以不加与加PDTC两种方式处理细胞模型后，再分别检测细胞的活力及凋亡。　　结果：1、两种目标lncRNAs在本细胞系中经OGD处理后均会表达升高，二者均是在OGD8h后表达最高，然后随OGD时间延长其表达再逐渐下降。二者在OGD4h及8h后的表达都有统计差异。6种siRNAs中siNR_120420Ⅰ、siNR_120420Ⅲ、siGCH1-2∶3Ⅰ及siGCH1-2∶3Ⅱ的敲低效率达到60％以上，后续选择这四种siRNAs作为敲低目标lncRNAs的工具siRNAs;2、本细胞系造模后细胞活力降低，TUNEL阳性细胞比例增高，流式凋亡细胞比例增高，提示造模在功能层面上是成功的。敲低NR_120420会升高本模型的细胞活力，会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例;敲低lnc-GCH1-2∶3对本模型的细胞活力、TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例无明显影响;3、敲低NR_120420后本模型中的P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的蛋白表达无明显变化，p-P65的蛋白表达显著降低;4、转染siNR120420Ⅰ和siNR_120420Ⅲ会升高本模型的细胞活力，会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例，而PDTC可以取消上述作用。　　结论：本部分研究选择了较合理可靠的研究设计和lncRNAs干预工具，NR_120420与lnc-GCH1-2∶3均会在本模型中发生显著变化，但只有敲低NR_120420对本模型的凋亡有抑制作用。NR_120420对脑梗死模型是起损害作用的。敲低NR_120420后本模型中NF-κB(p-P65)的蛋白水平会发生显著降低，NF-κB抑制剂可以取消NR_120420对本模型中凋亡的调控作用。　　小结：芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lncRNAs表达谱，后续的GO分析和Pathway分析显示异常表达的lncRNAs涉及凋亡与NF-κB活性。NR_120420和lnc-GCH1-2∶3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异，其中NR_120420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lncRNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度，二者在外周全血中的表达水平与脑梗死OCSP分型及预后有相关性。NR_120420与lnc-GCH1-2∶3均会在神经细胞OGD模型中发生显著变化，但只有敲低NR_120420对本模型的凋亡有抑制作用。敲低NR_120420后本模型中NF-κB(p-P65)的蛋白水平会发生显著降低，NF-κB抑制剂可以取消NR_120420对本模型中凋亡的调控作用。本研究筛选出了两种具有较高诊断价值的脑梗死潜在lncRNAs生物标志物，初步阐明了NR_120420在神经细胞缺血损伤后促进凋亡的具体机制，有望提高我国急性脑梗死的诊治水平。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 急性脑梗死后循环血lncRNAs的芯片差异表达谱及生物信息学分析

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分 循环血lncRNAs早期诊断急性脑梗死的价值及其与分型、预后的关系

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第三部分 lncRNA NR_120420促进神经细胞缺血损伤后凋亡的机制

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

附录

综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况

致谢