协同氟康唑抗耐药白念珠菌的小分子化合物设计、合成、生物活性和作用机制研究

摘要

真菌耐药的情况日益严重，尤其是念珠菌属，对各类抗真菌药物均出现不同程度的耐药性，如唑类药物、多烯类药物和棘白菌素类药物。而且其耐药机制错综复杂。侵袭性真菌感染在全球的发病率急剧上升，日益严重的真菌耐药性被公认为导致免疫缺陷病人侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐年升高的主要原因之一。其严重威胁到广大人民群众的健康安全，为建设健康中国，如何解决真菌耐药问题，研究出新型抗耐药真菌药物成为当务之急，同时有必要深入探索机会性真菌的耐药机制，为开发抗真菌新药提供新的靶点。　　小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物已被发现可以作为抗耐药白念珠的增效剂。国内外也有报道钙调磷酸酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂和热休克蛋白90抑制剂等也可协同唑类药物抗耐药真菌。虽然已有大量不同种类的化合物已被发现和报道具有协同抗真菌药物抗耐药真菌的活性，然而目前为止鲜有药物作为抗耐药真菌的增效剂上市，甚至于进入临床研究的都是寥寥无几。大量目前已报到的增效剂具有协同抗耐药真菌的活性MIC值一般在1.0μg/ml，而小于0.1μg/ml的增效剂是不常见的。增效剂活性不够好，可能为其原因一。至今为止，如小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物没有形成其作用机制清晰的结论，更没有发现关键的生物大分子，可能为其原因二　　在之前的研究中发现小檗碱具有协同FLC抗耐药真菌的作用，并对其进行改造获得几类结构更为简化，活性与小檗碱相当或略优于小檗碱的化合物。在这个研究基础上，挑选出本课题组已发现的活性最优的两个小分子作为先导化合物1-1和先导化合物1-2。并对其进行全面的结构改造，分别对其左侧的胡椒基，中间的酰胺键，右侧的芳环和柔链进行结构优化。通过体外活性筛选实验，采用微量稀释法和棋盘式微量稀释法获得化合物的活性数据。数据结果显示，具有协同抗耐药白念珠菌活性的的化合物有99个。与8.0μg/ml氟康唑合用时，MIC80小于0.1μg/ml的化合物有10个分别为化合物F2，F6，F8，F13，F14，F21，G8，G9，G10和G15，其中化合物F2、F6和F8采用棋盘式微量稀释法进一步证实其活性数据的可靠性。这类化合物的构效关系表明，其中先导化合物1-1中的胡椒基是其发挥生物活性的重要部分，酰胺键也是必不可少的部分，将酰胺键转变为逆酰胺键可以略微提高其生物活性，将苯环替换成对位联苯结构可以进一步提高其生物活性，将联苯结构中的一个苯环替换成噻吩环，可以保持与联苯类化合物相当的活性，另外当柔链长度为5-6个碳为最佳。　　由此，选择活性最优的化合物F6（CZ-66）对其进行抗耐药白念珠菌机制研究，对耐药菌103的ROS实验中，FLC、F5(CZ-65)单用不能引起ROS升高，F5(CZ-65)与FLC联用ROS升高约3倍，F6(CZ-66)单用ROS升高约10倍，F6(CZ-66)与FLC联用ROS升高约26倍。结果表明化合物F6(CZ-66)单用和联用FLC都能显著提高ROS水平，然而结构与其相似的化合物F5(CZ-65)单用时并未能提高ROS水平。对耐药菌103的罗丹明外排实验中，加入葡萄糖(2mM)后，罗丹明6G外排增强，且随着时间延长而增长。各用药组罗丹明6G外排与对照组无明显差异，说明化合物F5(CZ-65)、F6(CZ-66)、FLC及联用药对耐药菌103荧光蛋白外排无影响。CT-LINK反向分子对接找靶，通过PDB数据库检索，经分析CT-LINK中获取的可能靶点，只有Mitogen-activated protein kinase，NADH-ubiquinone oxidoreductase chain1和Mothers against decapentaplegic homolog3在真菌中是有报道存在的。结合已报道的相关参考文献，本文推测F6(CZ-66)可能作用于ROS-MAPK通路。另外本课题挑选了靶点相对明确的HSP90抑制剂BIIB021作为先导化合物2-1。对其嘌呤环上的2位、6位和9位分别进行结构改造，当保留先导化合物9位取代基，在2位和6位上进行简单改造，2位和6位分别以氯或者氨基做为取代基时，对化合物的活性影响并不大。如化合物H1-H3的MIC80均为4.0-8.0μg/ml之间。当9位的芳香环替换为脂肪环时，活性略有提升，其中以六元脂肪环为最优。当2位上引入芳环后，活性消失。因此，2位保留氟或氨基这类小原子团结构是保留化合物活性所必要的。化合物H12和H19是由先导化合物2-1改造获得的活性最优的两个化合物，虽然它们的活性并未超越由先导化合物1-1和1-2改造获得的化合物F6，但其活性与小檗碱相当，FICI优于小檗碱。作为一类靶点比较明确的分子，值得进一步结构改造和优化。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

课题设计思路

第一部分 协同氟康唑抗耐药白念珠菌的小分子化合物的合成

一．合成路线

二．实验步骤与结果

第二部分 小分子化合物协同抗耐药真菌作用研究

一．实验材料

二．实验方法

三．实验结果

四．讨论

第三部分 F6(CZ-66)对耐药白念珠菌的作用机制研究

一．实验简介原理与方法

二．实验结果

三．讨论

总结

参考文献

综述

致谢

附录