拓扑异构酶2a在中枢神经损伤后活化星形胶质细胞干细胞特性获得和维持中的作用

摘要

中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的损伤与修复是临床工作面临的一个重大难题。其中，脑外伤由于发病率高、预后差而成为了神经科学家关注的焦点。星形胶质细胞是CNS中数量最多、分布最广的一类胶质细胞。在生理情况下，星形胶质细胞与其他细胞有广泛的联系，对神经发育以及CNS正常生理功能的维持发挥着重要的作用;在CNS损伤后，星形胶质细胞可以活化、增殖并参与胶质疤痕的形成，从而阻止损伤病灶的进一步蔓延。近年来研究表明，与小胶质细胞和少突胶质细胞不同，一部分星形胶质细胞在CNS损伤后获得了干细胞特性。迄今为止，研究者们对于星形胶质细胞获得干细胞特性的具体分子机制尚不清楚。我们通过对已报道的正常星形胶质细胞与神经干细胞的基因表达进行数据库进行分析、验证，筛选出在神经干细胞中特异性表达的一些基因，发现拓扑异构酶2a对神经干细胞特性的维持非常重要。拓扑异构酶2a是拓扑异构酶家族中的一员。拓扑异构酶是一类高度保守的蛋白质，其蛋白分子由两个亚基组成，它通过调节核酸结构动态变化，在DNA复制、转录、重组以及染色体分离等生命活动中发挥重要作用。哺乳动物中存在拓扑异构酶Ⅰ(typeⅠtopoisomerase，TOP1)和拓扑异构酶Ⅱ(typeⅡtopoisomerase，TOP2)两种类型。TOP2又分为TOP2a和TOP2b两种亚型。TOP2b主要存在于终末分化的细胞中;而TOP2a对于分裂细胞的存活不可或缺。此外，在胚胎干细胞向神经细胞分化的过程中，TOP2表达存在a亚型向b亚型转换的现象。除了上述生理功能，近来发现TOP2a在病理情况下也具有重要作用，相关研究主要集中在肿瘤领域。已证实TOP2a跟乳腺癌、尿路上皮肿瘤、平滑肌肉瘤、肝癌等肿瘤细胞的增殖密切相关，各种针对TOP2a的靶点药物也呈现出一定疗效。然而，TOP2a在中枢神经系统损伤修复中的作用，目前尚未见相关报道。　　在本研究中，为了探究TOP2a是否参与了损伤后活化星形胶质细胞干细胞特性的获得与维持，我们首先建立了脑皮层损伤模型，检测星形胶质细胞在这种损伤模型下被活化以及相关干细胞分子标记物的表达情况，并在体外培养损伤周围的星形胶质细胞，发现损伤后活化星形胶质细胞的干细胞分子标记物的表达水平明显上调，在体外培养的条件下可以形成具有自我更新与分化特性的神经干细胞球。随后，我们观察了TOP2a在正常成年小鼠大脑中的表达，发现TOP2a只分布在侧脑室室管膜下区(SVZ)。在损伤模型中，我们也对TOP2a的表达进行观察。通过免疫荧光检测，我们发现小鼠脑皮层损伤后，损伤处周围开始表达TOP2a，且随着损伤时间的推移出现动态改变，即损伤后第3天可以检测到TOP2a，损伤后第5天、第7天TOP2a表达量逐渐下降，损伤后第14天TOP2a表达难以检测。在此过程中，我们检测了TOP2a与表达干细胞分子标记物的活化星形胶质细胞的共标情况，发现有一部分具有干细胞特性的活化星形胶质细胞与TOP2a表达相关。为了进一步明确是否TOP2a在损伤后活化星形胶质细胞干细胞特性的获得与维持中发挥作用，我们构建了GFAP-CreERT2;TOP2af/f条件性敲除小鼠。实验结果表明，在活化星形胶质细胞中敲除TOP2a后，损伤周围星形胶质细胞活化明显被抑制，细胞数量减少、增殖水平下降;活化星形胶质细胞的干细胞特性也受到破坏。随后，我们在体外培养脑损伤处周围的皮层组织，运用GFAP特异性启动子下驱动的TOP2a干扰病毒，我们发现脑损伤后活化星形胶质细胞来源的神经干细胞球明显变小、成球数量也减少。进一步运用TOP2a特异性抑制剂，我们发现活化星形胶质细胞来源的神经干细胞的自我更新能力完全被抑制。将活化星形胶质细胞来源的神经干细胞球进行RNA-seq检测，发现在运用了TOP2a特异性抑制剂后，神经干细胞球中的多潜能性相关基因明显下调，并且这种下调可能与转录因子Pax6的减少有关。综上所述，我们的研究表明TOP2a参与调控活化星形胶质细胞干细胞特性的获得与维持，这种调控可能由转录因子Pax6所介导。以上研究有助于我们进一步地了解CNS损伤的病理过程，并为CNS损伤修复寻找新的靶点与治疗策略。

目录

声明

摘要

缩写词汇

前言

一、实验材料

二、重要试剂配方

三、实验方法

四、统计分析

实验结果

一、星形胶质细胞在损伤后被活化并获得干细胞特性

二、TOP2a的脑内表达与分布

三、TOP2a是活化星形胶质细胞干细胞特性获得与维持所必需的关键分子

四、TOP2a可能通过调控转录因子Pax6来影响活化星形胶质细胞干胞特性的获得和维持

讨论

参考文献

文献综述

攻读硕士期间发表论文和参加科研工作情况

致谢