新型个体化组织工程骨的构建及体内外成骨作用的实验研究

摘要

研究目的：本课题旨在应用3D打印技术制备聚己内酯(PCL)支架，协同富血小板血浆(PRP)和骨形态发生蛋白2(BMP2)的促成骨作用，构建具有良好骨修复能力的个体化复合组织工程骨。　　研究方法：通过3D打印技术构建不同孔隙率的PCL支架并进行力学性能、孔隙率等相关检测。利用Landesberg二次离心法获取富血小板血浆(PRP)，通过血小板计数、电镜观察、HE切片染色等方法表征。利用冷冻干燥法制备PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨。　　采用全骨髓贴壁法获取、分离、培养新西兰大耳白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)，定期观察其生长状态，通过成骨、成脂肪、成软骨细胞“三系”分化及Western Blot、免疫荧光等检测方法进行鉴定。体外细胞水平观察PRP/BMP2协同促成骨分化能力，设立不同的分组：空白对照组、PRP组、PRP/BMP2组、成骨诱导液组，通过碱性磷酸酶染色、茜素红S染色法、PCR法检测成骨相关基因ALP、OCN的表达观察实验组促进成骨分化的能力。体外水平观察组织工程骨的促成骨分化及BMSCs的增殖能力，设立分组：单纯PCL支架（普通培养基组）、PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组、单纯PCL支架（成骨诱导液组），对各组碱性磷酸酶(ALP)活性进行测定，通过MTT法观察在单纯PCL支架（普通培养基组）、PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨中BMSCs的增殖情况。　　建立新西兰大白兔桡骨中段长15mm的骨缺损模型，共48只，分4组（每组6×2只）。设立分组：空白对照组、单纯PCL支架组、PCL/PRP复合支架组和PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组。分别在第4周和第12周获取组织标本进行大体观察和X线片观察骨缺损修复情况，并用Lane-sandHu X线评分法对12周的X线结果进行评分;组织切片行苏木精伊红(HE)和Masson三色染色进一步观察复合组织工程骨在组织学水平的骨修复效果。　　研究结果：通过3D打印技术可获取合适孔隙率及力学性能的PCL支架;通过Landesberg二次离心法可获取理想的富血小板血浆;通过冷冻干燥法可制备PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨。　　全骨髓贴壁法获得的兔BMSCs在镜下呈梭形且贴壁生长的细胞，培养过程中状态稳定;该细胞系在体外诱导条件下可向成骨、成脂肪及成软骨细胞分化，具备多功能干细胞的特点;表面标记物检测发现此细胞系表达CD29、CD44，不表达CD34、CD14。　　体外细胞水平观察各组促成骨分化的实验发现PRP/BMP2组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色的程度最高;且成骨相关基因OCN和ALP的mRNA表达水平明显高于空白对照组、PRP组及成骨诱导液组;PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组碱性磷酸酶蛋白(ALP)的活性定量明显高于空白对照组、PRP组及成骨诱导液组;在PCL/PRP复合支架中培养的BMSCs隔日MTT法所测的OD高于其他组。　　动物实验的大体观察及X线检查结果显示4周及12周时PCL/PRP/BMP2组中骨缺损区域新生骨明显优于PCL组、PCL/PRP组;12周时PCL/PRP/BMP2组的Lane-sandHu X线评分显著高于其余各组;HE染色及Masson染色结果进一步显示4周及12周时PCL/PRP/BMP2组新生骨组织明显多于PCL组、PCL/PRP组;而空白对照组两侧断端骨性闭合，骨缺损区少量骨组织生长，无法实现自我修复。　　研究结论：应用3D打印技术结合富血小板血浆和骨形态发生蛋白2可实现个体化复合组织工程骨的构建，此复合组织工程骨具有良好的骨修复能力，有望成为个性化修复临床骨缺损的方法之一。

目录

声明

摘要

缩略表

前言

参考文献

第一章基于3D打印技术的新型复合组织工程骨的构建

一、实验材料和主要设备

二、实验方法及步骤

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二章新型复合组织工程骨的体外实验

一、实验材料

二、实验方法及步骤

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三章新型复合组织工程骨的体内实验

一、实验材料

二、实验方法及步骤

三、实验结果

四、讨论

参考文献

全文总结

综述 3D打印技术在骨科相关领域的应用及研究进展

发表文章及参加的科研工作

致谢