创新药物CBMIDA和H2S的新型分析方法建立及其在制剂含量测定和药物动力学研究中的应用

摘要

金属络合剂和硫化氢供体药物是新药研发中两个较为特殊的对象，在对这两类化合物进行定量分析时，其特殊理化性质常导致精密度差，准确性低，定量线性范围窄等问题;现有这两类化合物的定量分析均通过较为耗时的衍生化方法实现，且方法难以重现。本文为放射性核素铀的促排剂双酚二胺四乙酸(CBMIDA)和第三类气体信号分子硫化氢(H2S)建立专属性强、灵敏度高、操作简便、易于重现、样品通量高、分析成本低的LC-MS/MS方法，并应用于其原料药与药物制剂的含量测定以及药代动力学研究，为新药申报提供技术和数据支持，也为同类型化合物的定量分析提供方法学参考。　　一、CBMIDA在体内外的LC-MS/MS分析方法建立及其在制剂含量测定和药物动力学研究中的应用　　在使用HPLC法对金属络合剂进行分析时，因其能够和分析系统中无处不在的金属离子发生络合而导致色谱峰畸形，分析精密度和准确度差，标准曲线线性范围窄。而目前多氨羧酸类螯合剂的测定方法几乎全部依靠测定其金属络合物来对络合剂进行定量。用于络合的金属种类、反应温度、pH、反应时间以及络合物的热力学稳定性均对络合物产率产生很大影响。待测物需要在较高温度下与适合的金属离子反应较长时间才能完全转化成同一种形式以供测定;此外这些方法液相分离多基于平衡时间较长、重现性较差的离子对色谱。　　本文选择耐酸、耐水且对极性和非极性化合物都有良好保留的Agilent Zorbax SB Aq柱作为分析柱，使用脉冲梯度色谱法并在流动相中加入甲酸和待测物的结构类似物EDTA，克服了金属络合剂分析中常出现的保留弱，峰形差，精密度、准确度和回收率低的问题，建立放射性核素铀的促排剂CBMIDA的快速、简便的体外LC-MS/MS测定方法。在流动相和样品溶液中加入EDTA可以掩蔽样品基质和分析系统中金属离子对络合剂测定的干扰，流动相中的酸可以抑制CBMIDA的解离，增加色谱保留，削弱金属配位能力，因而该方法可以直接测定CBMIDA原型药物，与现有螯合剂定量方法相比，具有更明显的简便性。应用该方法对CBMIDA的原料药和制剂进行含量测定，定量下限为25ng·mL-1，方法在25～2500ng·mL-1范围内具有良好的线性，精密度和重现性考察RSD分别为1.31％和1.27％。　　由于CBMIDA能够与血浆蛋白中的金属离子发生络合，血浆样品前处理蛋白沉淀剂中同样需要加入EDTA才能提高CBMIDA在血浆中的回收率。将体外分析方法直接应用于血浆样品分析时，由于部分CBMIDA能够与色谱柱上沉积的血浆基质发生结合，导致色谱峰拖尾，峰后基线高于峰前;通过增加甲酸浓度进一步抑制CBMIDA的解离，减少其在络合过程提供的配位原子的数量，同时提高掩蔽剂EDTA的浓度，可以使CBMIDA和沉积于色谱柱上的生物基质作用变弱，从而解决生物基质引起的色谱峰拖尾和峰后基线高于峰前的问题。在血浆样品分析方法学考察时，针对多氨羧酸类螯合剂的金属络合和代谢特性，增加考察了抗凝剂对待测物血浆浓度的影响、酰基葡糖苷酸代谢产物对动物体内原型药物含量测定的干扰以及待测物37℃全血温孵稳定性。所建立Beagle犬和SD大鼠血浆样品分析方法专属性、精密度和准确度高，在0.1～10μg·mL-1范围内呈良好线性，可成功应用于CBMIDA在Beagle犬体内的药代和毒代动力学研究以及SD大鼠体的药代动力学研究。本文所建立血浆样品分析方法与现有金属络合剂分析方法相比具有样品前处理条件温和、操作简单、样品通量高、定量线性范围较宽且耐用性强的特点，此外，针对儿茶酚多氨羧酸类螯合剂的特点，增加方法学考察的内容，因而该方法对儿茶酚多氨羧酸类螯合剂的生物样品分析方法优化具有实际参考价值。　　二、基于NBD捕获探针的H2S供体药物制剂含量测定和药物动力学研究　　H2S是继NO和CO之后的第三类气体信号分子，已被证实能够参与多种疾病的进程，可用于心血管疾病、消化道疾病、急慢性炎症、帕金森病和阿尔茨海默病等疾病的治疗，因而H2S供体也成为新药研发的候选药物。目前公认的专属性强、灵敏度高的H2S定量分析方法以价格昂贵的单溴二胺(MBB)作为衍生化试剂，反应条件复杂苛刻，且生物样品定量分析的标准校正样品均为以缓冲溶液配制的反应产物(SDB)标准溶液，未考虑待测样品的基质效应和基质提取回收率对分析准确度的影响，不同课题组优化所得的最佳反应条件不一致，测得的同种动物体内H2S的基线水平差别较大。开发反应简单，精密度、准确度和重现性好，成本低的新分析方法可推动H2S生理病理机制研究的深入和H2S供体药物的研发。　　本文基于NBD醚的硫解反应，选择常用的色谱改性剂4-Cl-NBD和以之为原料合成的四个探针NBDOMe、NBDOEt、NBDOTFE和NBDOCMR作为捕获剂对还原性、挥发性较强的H2S进行LC-MS/MS定量。本文首先建立探针、探针与H2S反应的产物和可能的副产物以及探针水解产物的LC-MS/MS检测方法，对上述五个探针与H2S的最佳反应条件进行优化，并对探针的稳定性、选择性、反应速度和与H2S定量反应的灵敏度和线性进行考察。然后选择与H2S定量反应线性较好的NBDOEt和4-Cl-NBD对H2S进行衍生化检测。这两个方法定量下限均为50nM，标准曲线在50n～5μM浓度范围线性良好，样品处理简单，精密度、准确度高，重现性好，被成功应用于Na2S·9H2O原料药和注射液中Na2S的含量测定。采用NBDOEt和4-Cl-NBD对H2S进行衍生化检测的灵敏度和线性与标准MBB法相当，但反应条件更加简单，且探针成本仅为MBB的十分之一。　　考察以NBDOEt和4-Cl-NBD探针对大鼠血浆中的H2S进行捕获分析的回收率和灵敏度，结果发现，由于H2S在体内主要以结合状态存在，以体外专属性较好、反应速度较快的NBDOEt探针对SD大鼠血浆中的H2S进行测定的回收率小于30％，且精密度和重现性差，在血浆中加入抗氧化剂和巯基化合物常用还原剂并不能提高回收率。而专属性较差的4-Cl-NBD探针在pH为9.5左右可以和血浆中的硫化物(RSH)发生特殊反应而生成与H2S反应相同的产物NBDSH。由于内源性硫化物的干扰，Na2S血浆标准曲线线性无法达到生物分析要求，不能作为定量标准曲线。本文考察了H2S全血和血浆稳定性、H2S血浆标准曲线各浓度点的回收率以及NBDSH在血浆中的线性、精密度和回收率;结果，H2S加入血浆和全血中之后10min内稳定;H2S血浆标准曲线各浓度点绝对回收率在250％～500％范围内，但是同一浓度点回收率重现性良好，虽然标准曲线线性相关系数r2小于0.99，但产物响应与Na2S浓度呈正相关，标准曲线斜率重现性好;NBDSH血浆标准曲线在0.1～20μM范围内成良好线性，精密度考察LQC、MQC和HQC的平均绝对回收率分别为119.26％、86.75％和81.41％，RSD均小于15％;这些结果证实了以NBDSH的血浆标准曲线为定量校正曲线的合理性。此外，对每个实验对象采集多个空白点扣除平均背景值以消除内源性硫化物的干扰。最后，将血浆制备时间控制在10min以内=并以NBDSH血浆标准曲线为定量校正曲线，本文可以准确测定SD大鼠尾静脉注射Na2S注射液后体内H2S的变化。本文所建立SD大鼠血浆中H2S的测定方法样品前处理简单，充分考虑到反应回收率、基质效应和内源性干扰对分析准确度的影响，精密度和准确度高，重现性好。该方法为今后H2S的病理生理机制和药代动力学研究提供新的技术思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章绪论

二、铀促排剂的研究现状

(一)铀的危害与其促排剂的研究

(二)金属络合剂对分析方法的挑战

三、H2S检测方法研究现状

(一)H2S的体外定量分析方法

(二)生物样品中H2S的检测方法

(三)H2S荧光探针研究进展

四、本课题的研究思路

参考文献

第二章CBMIDA的体外LC-MS／MS分析方法建立及制剂含量测定

一、引言

二、实验部分

(一)仪器

(二)药品与试剂

(三)LC-MS／MS方法

(四)溶液配制

(五)方法学考察

(六)含量测定

三、结果与讨论

(一)LC-MS／MS条件的优化

(二)流动相添加剂的选择

(三)方法学考察

(四)CBMIDA原料药和冻干粉针剂中CBMIDA含量的测定

四、本章小结

参考文献

第三章CBMIDA在Beagle犬血浆中的LC-MS／MS分析方法建立及Beagle犬体内的药代和毒代动力学研究

(一)仪器

(二)药品与试剂

(三)实验动物

(四)Beagle犬血浆样品前处理方法

(五)LC-MS／MS方法

(六)样品配制

(七)方法学验证

(八)CBMIDA在Beagle犬体内的药代动力学研究

(九)CBMIDA在Beagle犬体内的相伴急毒性试验毒代动力学研究

(十)CBMIDA在Beagle犬体内的相伴长期毒性试验毒代动力学研究

(十一)数据分析

三、结果与讨论

(一)样品前处理方法的优化

(二)色谱分离条件的优化

(三)方法学考察

(四)CBMIDA在Beagle犬体内的药代动力学研究

(五)CBMIDA在Beagle犬体内的相伴急毒性试验毒代动力学研究

(六)CBMIDA在Beagle犬体内的相伴长期毒性试验毒代动力学研究

四、本章小结

参考文献

第四章CBMIDA在SD大鼠血浆中的LC-MS／MS分析方法建立及SD大鼠体内的药代动力学研究

(一)仪器

(二)药品与试剂

(三)实验动物

(四)SD大鼠血浆样品前处理方法

(五)LC-MS／MS方法

(六)样品配制

(七)法学验证

(八)SD大鼠体内CBMIDA的药代动力学研究

三、结果与讨论

(一)方法学考察

(二)CBMIDA在SD大鼠体内的药代动力学研究

四、本章小结

参考文献

第五章H2S捕获探针的合成、LC-MS／MS分析方法建立和性质研究

一、引言

二、仪器和试剂

(一)仪器

(二)试剂

三、实验部分

(一)探针及其与H2S反应产物的合成

(二)探针与H2S反应产物的检测

(三)探针与H2S反应条件的优化

(四)探针与H2S反应时间的选择

(五)探针对H2S的选择性研究

(六)探针应用于H2S定量分析的灵敏度和线性研究

四、结果与讨论

(一)探针的合成与测定

(二)探针与H2S反应产物的检测

(三)探针与H2S反应条件的优化

(四)探针对H2S的选择性研究

(五)探针应用于H2S定量分析的灵敏度和线性研究

五、本章小结

参考文献

第六章H2S柱前衍生化LC-MS／MS检测方法学验证及其在硫化钠注射液含量测定中的应用

一、引言

二、仪器与材料

(一)仪器

(二)药品与试剂

三、方法与结果

(一)LC-MS／MS方法

(二)溶液配制

(三)H2S衍生化方法

(四)方法学验证

(五)Na2S·9H2O原料和注射液含量测定

四、讨论

五、本章小结

参考文献

第七章H2S在SD大鼠血浆中的LC-MS／MS分析方法建立及SD大鼠体内药代动力学研究

一、引言

二、仪器与材料

(二)药品与试剂

(三)实验动物

三、实验部分

(一)样品的配制

(二)SD大鼠血浆样品前处理方法

(四)H2S在SD大鼠血浆中的LC-MS／MS分析方法验证

(五)H2S在SD大鼠体内的药代动力学研究

四、结果与讨论

(一)H2S在SD大鼠血浆中的LC-MS／MS分析方法建立

(二)H2S在SD大鼠血浆中的LC-MS／MS分析方法验证

(三)H2S在SD大鼠体内的药代动力学研究

五、本章小结

参考文献

全文总结及创新点

附录

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢