HOTTIP与MYC正反馈交互调控促进骨肉瘤发生发展的功能研究

摘要

研究背景：　　骨肉瘤（Ostesarcoma）作为一种常见的恶性骨组织肿瘤，在儿童及青少年人群中发病率较高，超过3/4的患者发病年龄在15-25岁之间，且男性患者数量多于女性患者。骨肉瘤具有肿瘤易转移、肿瘤恶性程度高、发病年龄早、生长迅速等特点。传统治疗方法通常为手术切除加化疗治疗，但经过这种常规治疗的患者五年生存期不足70%，肿瘤预后情况非常不乐观，其中转移和复发患者的长期生存率不足20%。遗憾的是，目前临床上尚未有更好治疗效果的相关报道。因此，通过基因水平和分子水平来了解骨肉瘤的发生、发展、迁移就显得非常有意义，其研究结果能够在临床上对骨肉瘤的治疗提供全新的思路和解决方案。　　骨肉瘤发病的确切分子机制尚未阐明，研究表明长链非编码 RNA （ Long non-coding RNA，LncRNA）在骨肉瘤发生发展及侵袭转移中发挥重要作用。HOXA远端末端转录本(HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP)，是一类常见的长链非编码RNA，是从HOXA13基因反义链所转录而来的，一条长达4665个核苷酸的LncRNA。基因芯片分析提示，在骨肉瘤细胞中，HOTTIP表达量明显升高，定量PCR（qPCR）实验也验证了这一结果，这说明HOTTIP在骨肉瘤的形成和发展中起到了关键性的作用。此外，作为肿瘤研究领域备受关注的长链非编码RNA，HOTTIP在骨肉瘤中的高表达也被认为与患者较差的预后相关。　　研究目的：　　在本研究中，我们将主要探讨HOTTIP在骨肉瘤细胞增殖、上皮细胞间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）和迁移侵袭中的作用，以及原癌基因MYC与HOTTIP之间的正反馈交互调控机制。通过实验设计试图阐明1) HOTTIP在骨肉瘤组织中的表达与肿瘤级别、病灶转移、病情复发等临床特征的相关性，2) HOTTIP敲低或过表达对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移和EMT作用；3) MYC与HOTTIP之间的正反馈交互调控机制，明确HOTTIP在MYC诱导骨肉瘤发生及转移中的桥梁作用。　　研究方法：　　首先我们收集了25例骨肉瘤病人的肿瘤组织与配对远癌非肿瘤对照组织，用RT-PCR检测了HOTTIP mRNA的表达水平。除了病人的组织样本，我们还用相似的方法检测了人成骨细胞和骨肉瘤细胞系中HOTTIP的表达量。随后我们采用RNA干扰技术分别在两个骨肉瘤细胞系中敲低了HOTHIP的表达量，再对这些细胞进行培养，从不同角度对肿瘤进行了评估，主要包括：1.用CCK-8实验检测了骨肉瘤细胞的活动和增殖能力；2. 用transwell实验检测了骨肉瘤细胞的侵袭能力；3.用细胞划痕实验检测骨肉瘤细胞的迁移能力；4.用Western Blot实验检测骨肉瘤细胞EMT标记物的表达水平，评估其EMT能力。　　原癌基因C-MYC的表达是肿瘤生长和转移过程中的重要标志基因。我们分别用RT-PCR和Western Blot检测了两组HOTTIP敲低的骨肉瘤细胞系中， C-MYC和β-catenin的表达情况。为进一步评估C-MYC的作用，我们在两个骨肉瘤细胞系中过量表达了C-MYC基因，又重新检测了骨肉瘤细胞的生长、迁移、侵袭和EMT能力。　　研究结果：　　1）通过对比骨肉瘤组织与配对远癌非肿瘤对照组织，我们发现骨肉瘤组织中LncRNA HOTTIP的表达水平显著高于非肿瘤对照组织（P＜0.01）。同样，骨肉瘤细胞系（SaoS2，HOS，U-2OS和MG6）中的HOTTIP表达量显著高于成骨细系（hFOB1.19） （P＜0.01）2）成功敲低HOTTIP的骨肉瘤细胞（U-2OS和MG6）生长速度明显被抑制。HOTTIP表达水平越低，肿瘤细胞生长越慢（P＜0.001）。3）成功敲低HOTTIP的骨肉瘤细胞（U-2OS和MG6）的侵袭能力、迁移能力和上皮细胞间充质转化程度明显减弱（P＜0.01），两者呈正相关。4）在成功敲低HOTTIP的骨肉瘤细胞（U-2OS和MG6）中，原癌基因C-MYC的表达也显著降低（P＜0.01），这说明C-MYC与HOTTIP的表达呈正相关。 5）若骨肉瘤细胞中过量表达C-MYC，则HOTTIP表达水平也明显升高（P＜0.01），细胞的侵袭能力和迁移能力增强（P＜0.01），说明在骨肉瘤发展过程中，C-MYC同HOTTIP之间是正反馈调节的。　　研究结论：　　1）HOTTIP在骨肉瘤的发生发展过程中扮演着关键角色，HOTTIP的过表达程度越高，骨肉瘤的恶性程度就越高；2）HOTTIP的敲低会抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT作用；3）敲低HOTTIP可诱导β-catenin和C-MYC在mRNA和蛋白水平上的降低。而原癌基因C-MYC的过表达通过上调HOTTIP的表达水平，从而增强了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力，说明在骨肉瘤发展过程中，C-MYC同HOTTIP之间是正反馈调节的。本论文的研究将加深对骨肉瘤发病机理的认识，为揭示骨肉瘤发病的分子机制提供重要启示，最终为骨肉瘤的临床治疗提供可能的新方法和新靶点。

目录

缩略词表

一、绪论

（一）骨肉瘤严重危害人类健康

1. 骨肉瘤的基本特征

2. 骨肉瘤的成因

3. 骨肉瘤的诊断与治疗

4. 骨肉瘤的预后

（二）长链非编码RNA

1. LncRNA的基本特征

2. LncRNA的主要功能

3. LncRNA与疾病

（三）研究长链非编码RNA在骨肉瘤发病中的作用具有重要的意义

1. LncRNA影响肿瘤发生和发展

2. 与骨肉瘤相关的LncRNA

（四）长链非编码RNA是骨肉瘤研究备受关注的新热点

（五）HOTTIP表达上升与骨肉瘤发生发展的相关性

（六）本课题的研究设想

二、实验材料与研究方法

（一）研究对象

（二）研究方法

（三）实验材料

1. 主要实验试剂和耗材

2.实验试剂配置过程

（四）实验方法

1. 细胞准备

2.实验过程

3. 细胞转染

4. CCK-8实验

5. 细胞划痕实验

6.细胞侵袭实验

7. Western Blot 实验

8. 质粒的提取

9.数据分析处理

三、实验结果

（一）HOTTIP在骨肉瘤组织及细胞中的表达情况

（二）抑制HOTTIP能够在细胞水平上抑制骨肉瘤的发生

（三）敲低HOTTIP后，骨肉瘤细胞的侵袭、迁移和EMT

（四）HOTTIP调节骨肉瘤中C-MYC基因的表达

（五）C-MYC的表达通过积极调节HOTTIP进而影响骨肉瘤细胞中的细胞侵袭和迁移

四、讨论

五、不足与展望

参考文献

全文总结

综述:长链非编码RNA在骨肉瘤的进展、转移和预后中的作用

博士在读期间发表文章

致谢