MYH3基因突变在先天性脊柱畸形发病中的作用及机制研究

摘要

先天性脊柱畸形(congenital vertebral malformations，CVM)是由于胚胎期脊柱发育异常所引起的一组以脊柱畸形为主要临床表现的疾病。流行病学调查发现其在新生儿中的发病率在0.5-1‰左右。由于致畸因素存在于成长发育高峰期之前，当患者进入脊柱发育高峰期时，畸形进展通常比较迅速。躯体畸形、疼痛易诱发严重心理问题，加之高昂的手术费用等，给家庭和社会造成巨大的负担。　　CVM病因不明，目前普遍认为遗传学因素是其致病的重要原因，因此也是病因学研究的热点。通过遗传学手段如针对CVM家系的连锁分析发现基因组中的特定区域的拷贝数变异，如染色体16p11.2、10q24.31、17p11.2、21p11、22q11.2等区域与疾病关系密切;根据候选基因策略发现PAX1、WNT3A、DLL3、SCL35A3、T(Brachyury)等多个基因的罕见变异可能与CVM的发生相关;基于全外显子测序(whole-exome sequencing，WES)和全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)的基因筛查技术也提示TBX6、LMX1A、HES7等基因的多态性及罕见突变与CVM密切相关。然而上述诸多遗传学变异在CVM人群中整体覆盖率较低，疾病的遗传学机制仍需进一步探索。此外，具体到某一类型的病因后，由于病例数量较为有限，难以对基因型与患者表型间的内在联系进行发掘。同时上述遗传学变异导致CVM发生的具体分子生物学机制也缺乏深入的研究，使得筛选特异性分子标记物对CVM进行早期筛查及诊断较为困难。因此进一步探索CVM的遗传学病因并对其机制展开深入研究，将为患者的早期诊断和干预提供新的思路。　　基于遗传异质因素的已知基因变异和新发突变的筛查，仍然是目前CVM疾病遗传学研究的重点之一。CVM的病理机制主要包括骨形成、骨发育以及骨结构维持过程的异常。针对此类遗传性疾病致病基因的筛查，有助于提高对相关基因功能及骨发育过程中有关调控机制的认识。此外，实践证实针对家族性聚集人群的研究更具有遗传学研究的价值，更利于寻找到遗传疾病的致病基因。然而根据文献复习发现，国内外尚未见基于CVM大家系的遗传学及分子生物学研究报道。此外，在人类基因组仅占整体序列1％的外显子区域包含了绝大多数遗传性疾病表型相关的变异，因此是新一代测序技术(next-generation sequencing，NGS)中重点关注的领域。随着近年来WES技术的不断进步，催生了基于大样本数据库的的突变预测软件以及基于实验的对突变蛋白质结构和功能进行研究的成熟方法，因此在家系患者致病基因的筛查中，WES在经济和效率层面都显示了巨大优势。　　研究目的：　　探寻一个来自中国汉族、呈常染色体显性遗传的CVM家系患者的致病基因，验证该基因的功能并研究其突变后导致CVM可能的致病机制。通过我们的工作，期望能拓展基因相关疾病谱，并为CVM在病因学领域的早期诊断和早期干预提供基础。　　研究内容与方法：　　1、收集来自中国汉族CVM家系成员的血液样本并进行WES及数据分析，靶定到致病基因肌球蛋白重链3(myosin heavy chain3，MYH3)基因后进一步在散发病例和正常对照人群中进行了验证。归纳、总结家系患者的临床表型，并与同样携带有该基因突变的散发病例患者的临床表型进行比较。　　2、通过野生型C57B/L小鼠在胚胎期及出生后不同时间点的脊柱组织切片的免疫组化染色，观察Myh3基因编码蛋白在小鼠不同发育阶段的脊柱组织中的表达。　　3、收集临床上病理诊断明确且细胞来源不同的脊柱骨肿瘤标本，观察肿瘤组织中MYH3蛋白的表达情况。　　4、体外进行人脐带来源间充质干细胞的培养并诱导其成骨/成软骨分化，在不同的时间点提取总RNA和细胞蛋白，观察在干细胞成骨/成软骨分化过程中MYH3基因表达的时间和空间模式。　　5、运用计算机进行蛋白三维结构模拟预测，评估MYH3基因突变(c.695G＞A:p.G232E)对编码蛋白结构及功能的影响;构建携带野生型与含有上述突变序列的MYH3质粒，转染细胞后用鬼笔环肽行细胞骨架染色，观察突变对细胞骨架的影响;利用ATP试剂盒检测各组细胞内ATP浓度水平以评估突变对编码蛋白结合与水解ATP能力的影响;并应用Western Blotting技术检测了MYH3蛋白及TGF-β/BMP信号通路中的关键蛋白在转染不同质粒细胞间的表达水平差异。　　6、通过ES打靶技术构建了Myh3G232E/+C57BL/6J点突变转基因小鼠模型，并在小鼠模型中观察了基因突变对小鼠脊柱区骨与软骨形成过程的影响。　　研究结果：　　1、MYH3基因8号外显子上的单核苷酸错义突变(c.695G＞A:p.G232E)可能是该汉族CVM家系患者的致病原因;同时通过15名CVM患者的WES发现其中2名患者分别携带有位于MYH3基因31和37号外显子区域的罕见变异(5375A＞G，4324G＞A);此外在120名正常对照人群中未观察到该位点的突变，提示这是一个罕见的突变。利用软件对上述3个位点基因突变的效应进行预测，结果均为“Damaging”，提示这些位点的突变可能对编码蛋白质的结构与功能产生较大影响。　　2、虽然突变位点不同，但在2名携带MYH3基因突变的散发CVM患者中，同样可以观察到与家系患者类似的、不伴髓内发育异常的颈、胸椎融合和脊柱侧弯畸形等表型，提示携带MYH3基因突变的CVM患者中可能存在着基因型-表型相关的特点。　　3、家系中年幼患者仅可观察到椎间隙高度减小、部分椎体间融合伴轻度脊柱侧弯，但在家系成年患者中可见广泛的椎体间融合、脊柱侧弯畸形较重，提示随着年龄增大，家系中患者脊柱畸形、融合等改变可能在不断进展。　　4、证实Myh3基因编码蛋白在胚胎期及出生后早期的小鼠脊柱区，特别是椎弓表面附着的小肌群、成骨活跃的椎体两端生长板及神经中心软骨联合部位的软骨细胞肥大成熟区均有显著表达，且在椎体中可观察到MYH3与ALP蛋白在表达上的共定位现象。　　5、脊柱肿瘤组织切片的免疫组化染色发现该蛋白主要表达在成骨细胞系中，且随着分化成熟程度的提高，ALP活性增强，而MYH3表达呈下调趋势，提示MYH3可能还参与到骨组织的成骨分化成熟过程。　　6、在hUCMSCs诱导成骨分化中期(2-3w)发现MYH3mRNA的表达量急剧升高，并与Western Blot检测的相应时间点细胞内MYH3蛋白的表达趋势一致;且MYH3mRNA的上调早于成骨相关基因OCN mRNA的表达上调，说明该基因可能参与成骨，尤其是软骨内成骨的过程中，并可能在成骨分化的早/中期发挥作用，因此可能在成骨相关基因的上游发挥其生物学效应。　　7、MYH3蛋白第232位点在不同的物种间序列高度保守，通过软件模拟分析发现该位点由非极性氨基酸甘氨酸变为酸性氨基酸谷氨酸后，将导致位点附近氨基酸残基-残基间的相互作用发生改变，进而使蛋白质二级结构在空间位置发生改变，最终使MYH3蛋白的整体结构发生改变，并可能对蛋白质的功能产生影响。　　8、MYH3基因发生突变后在蛋白层面可能影响MYH3蛋白结合水解ATP向肌动蛋白细胞骨架上施加力以及维持细胞骨架形态的能力;在细胞层面上将引起MYH3蛋白在胞内分布模式以及与胞内其他蛋白的相互作用发生改变，并可能对细胞的极性形成产生影响。　　9、MYH3蛋白整体上可激活TGF-β/BMP经典和非经典通路的活性水平，且在该基因c.695G＞A位点发生点突变后，其激活该通路的能力明显下降。说明MYH3蛋白可能是TGF-β/BMP通路的调节蛋白之一。　　10、与野生型小鼠相比，Myh3点突变小鼠在出生后5-8w时的体重及体长较野生型小鼠偏低（小）;出生后早期即可从大体及X线片上观察到鼠尾弯曲、脊柱胸段侧弯畸形;此外出生后1d还可通过骨架染色观察到点突变小鼠体长变短，肋骨发育异常，肋软骨显示不清，并可见轻度脊柱侧弯伴胸椎前凸增大，且在突变小鼠颈椎直至胸椎椎体间可见广泛骨性融合畸形。　　研究结论：　　通过以上研究，证实了MYH3基因罕见变异(c.695GA;p.G232E)是该CVM家系患者的致病原因。该基因发生突变后，除对椎旁肌收缩能力产生影响致双侧椎旁肌收缩应力不对称外，还能通过影响细胞能量代谢、细胞骨架的维持、细胞极性及对TGF-β非经典/经典信号通路中关键元件的磷酸化调控等多方面作用，抑制软骨细胞成骨分化;小鼠生长板软骨分化过程受影响后，小鼠椎体两端的二级骨化中心生长板的增殖动力学发生差异、椎体两侧纵向生长不对称和楔形变，最终产生观察到的转基因小鼠脊柱畸形表型。　　在此项研究中，基于一个CVM家系中靶定到的MYH3基因罕见变异开展了相关研究，结果提示该基因突变导致脊柱畸形的发生机制一方面可能是通过影响连接神经弓的椎板小肌群的收缩功能，另一方面还可能是通过影响椎体内的软骨内成骨过程，最终引起椎体骨发育畸形及融合畸形。针对骨发育不良性遗传病致病基因的筛查，提高了对相关基因功能及其在骨发育过程中相关调控机制的认识。但是同时应认识到骨形成、骨发育以及骨结构维持是一个极为复杂的过程，现阶段对其认识还极为有限，进一步的系统而深入的研究任重而道远。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分基于家系的先天性脊柱畸形致病基因的筛查

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分MYH3在小鼠脊柱发育及干细胞诱导成骨分化过程中表达的时空规律

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分MYH3基因突变对编码蛋白质结构与功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第四部分点突变小鼠模型评价Myh3基因突变对脊柱发育的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 先天性脊柱畸形及MYH3基因相关遗传病研究进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况

致谢