EIF3D在前列腺癌中的作用机制研究

摘要

前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是严重危害老年男性生命健康的恶性肿瘤，目前，美国男性中前列腺癌是发病率第一，死亡率位居第二的恶性肿瘤。近年来，我国前列腺癌的发病率逐年增加，并且呈现年轻化趋势，同时晚期前列腺癌的比例约占70%。成为我国老年男性的重大健康问题。随着医学研究的不断进步和分子生物学的发展，人类对于肿瘤的治疗手段变得多种多样，并不仅仅局限于传统的手术治疗、化疗和放疗，靶向治疗也受到了越来越多的关注。靶向治疗是指以导致或促进肿瘤发生发展以及转移的某种特定的基因片段为目标，设计药物对其进行定点攻击的治疗手段，能够特异性靶向杀死肿瘤细胞，并且对于周围肿瘤周围正常细胞不具备杀伤作用。　　基因的表达调节发生在多个水平，其中尤为重要的转录水平和转录后水平等。该过程中任何一步的异常都会引起基因的异常表达、细胞恶性增殖，最终导致肿瘤的发生。真核翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factors，EIFS）复合物在翻译起始的过程中发挥了核心作用，参与了其中的大部分反应，而且有研究显示该家族成员还通过调节不同类型的mRNA的翻译起始环节，选择性地控制蛋白的合成，从而导致细胞繁殖受限。　　既往研究发现EIF3D对蛋白合成起到不可或缺的作用，胃癌接受顺铂和氟尿嘧啶联合治疗的患者、其中出现耐药性的患者体内检测到了EIF3D的高表达，说明EIF3D的表达与化疗药物耐药性的发生相关。在恶性间皮瘤中，利用siRNAs敲除39个基因后发现，EIF3D是一个潜在的药物治疗靶点，它的沉默可以诱导癌细胞发生凋亡。此外，在黑色素瘤细胞中，沉默EIF3D基因可以明显降低癌细胞的活性和增殖能力并使细胞发生G2/M周期阻滞。　　基于此，本研究主要聚焦于EIF3D在前列腺癌中发生、发展中的作用。首先，本研究进行了EIF3D的组织水平表达检测。材料为前列腺癌组织和癌旁组织的石蜡切片，检测结果发现EIF3D在癌组织阳性率明显高于癌旁组织。为了进一步研究EIF3D在细胞水平的功能，本研究先构建了EIF3D-RNAi的慢病毒载体。利用构建成功的载体建立EIF3D表达沉默的前列腺癌细胞模型（激素非依赖前列腺癌细胞系PC-3和DU145）进行后续的功能研究。结果发现，转染EIF3D-RNAi慢病毒载体转染后前列腺癌细胞EIF3D的mRNA和蛋白质表达水平抑制85%以上。　　在细胞水平，转染EIF3D-RNAi慢病毒载体对激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3和DU145细胞表型的影响，细胞功能检测我们采用MTT法检测细胞增殖情况、细胞克隆形成能力、流式细胞仪进行周期检测和Transwell法检测检测细胞的侵袭能力。结果发现，降低EIF3D的表达可以有效抑制这两株细胞的增殖、克隆形成和迁移能力，同时能够把细胞周期抑制在G2/M期，差异均有统计学意义。经过数量统计发现，EIF3D对细胞增殖和克隆形成的抑制作用都可以达到50%以上。结果表明，在前列腺癌细胞中利用EIF3D-RNAi的慢病毒载体沉默EIF3D表达明显抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移等恶性表型，说明EIF3D可以作为前列腺癌的一个癌基因。也为临床治疗靶点的确定提供了依据。相信在未来经过扩大临床样本和更多实验手段的验证，EIF3D将可能为前列腺癌的靶向治疗带来光明前景。

目录

声明

缩略词表

前言

一、前列腺癌的概况

二、真核翻译起始因子EIF3家族与前列腺癌

（一）EIF3在癌症中的过表达

（二）EIF3在癌症中的表达缺失

三、课题研究的目的和意义

第一部分：EIF3D与前列腺癌的临床相关性研究

一、引言

二、实验材料

（一）标本来源

（二）试剂及其配制：

（三）主要仪器

三、实验方法

（一）免疫化学

（二）实时定量PCR

（三）标本取材

（四）实验数据处理与统计学分析

四、实验结果

（一）EIF3D在前列腺癌和癌旁组织中的表达

五、讨论

第二部分：EIF3D-RNAi慢病毒载体构建和包装

一、引言

二、实验材料

（一）载体系统

（二）细胞与菌种

（三）试剂及其配制

（四）实验仪器

三、实验方法

（一）针对EIF3D基因的siRNA设计与DNA序列合成

（二）慢病毒shRNA载体的构建

（三）慢病毒包装

（四）实验数据处理与统计学分析

四、实验结果

（一）EIF3D-RNAi慢病毒载体的构建

（二）慢病毒包装的转染效率

（三）滴度检测

五、讨论

第三部分：细胞水平功能验证

一、引言

二、实验材料

（一）细胞系

（二）试剂及其配制

（三）主要仪器

三、实验方法

（一）细胞培养

（二）慢病毒感染实验

（三）总RNA提取、cDNA模板制备及实时定量PCR

（四）蛋白抽提及免疫印迹检测

（五）细胞增殖检测—MTT法

（六）细胞增殖检测—克隆形成

（七）细胞周期

（八）Transwell肿瘤细胞迁移实验

（九）实验数据处理与统计学分析

四、实验结果

（一）EIF3D在前列腺癌细胞系中的基础表达水平检测

（二）EIF3D慢病毒载体转染效率验证

（三）沉默EIF3D后检测对细胞增殖的影响

（四）沉默EIF3D后检测对细胞克隆形成的影响

（五）沉默EIF3D后检测对细胞周期的影响

（六）沉默EIF3D后检测对细胞迁移的影响

五、讨论

结论与展望

结论

展望

参考文献

综述:EIF3 家族在肿瘤中的研究进展

致谢