压力及压力应答miRNA--5703对肝癌生长和转移的影响

摘要

肝癌是目前世界范围内癌症死亡的主要原因之一，亚洲发病率最高，中国新发肝癌占世界新发肝癌的50.5％。MiRNA(microRNA)是一种小的非编码RNA，已经作为基因表达的关键转录后调节RNA出现，其作用是通过靶向mRNA进行翻译抑制或失稳。机械压力应答miRNA在心血管系统疾病中已经得到了广泛的研究，然而，miRNA在肝癌压力微环境中对肝癌发展所起到的作用尚未有研究，压力对肝癌的病理生理学作用也未有报道。　　目的：　　在最佳压力加载条件下通过芯片筛选差异表达的miRNAs和mRNAs。经过生物信息学分析找出并验证压力应答miRNA及其预测靶基因，通过细胞实验探索靶基因所在信号通路及压力和压力应答miRNA对通路蛋白表达的影响，通过裸鼠成瘤实验及对肝癌临床样本的检测再次验证压力应答miRNA及其靶基因在机械压力作用下的肝癌生长和转移中所起到的作用。　　方法：　　1、细胞培养:　　(1)肝癌细胞2D培养:细胞系HepG2，Huh-7，MHCC97H，HL-7702的培养条件:10％的胎牛血清(FBS，fatal bovine serun)配于高糖培养基(DMEM，Dulbecco'sModified Eagle's medium)，与37℃的CO2浓度为5％的培养箱培养。　　(2)肝癌细胞3D培养:将细胞悬浮于1×Accutase酶中浓度调节到6×106个/mL，然后将细胞悬浮液、水、10×CB和Mal-Dextran的混合物与PEG-link完全混合。3次快速吹扫后，将混合物静置5分钟，在3D水凝胶固化后，加入适量的含10％FBS的DMEM，培养4h以待后续实验。　　2、压力加载:　　(1)2D培养肝癌细胞系加压:取肝癌细胞系置于我课题组自行研制的二维培养细胞压力装置内，装置盖子入口阀和出口阀分别连接氮气罐和血压计，并缓慢注入氮气，压力上升至相应压力值后，关闭阀门，加载相应时间后取出细胞并进行后续实验。　　(2)3D培养肝癌细胞系加压:使用Flexcell-5000C压缩系统对3D培养的细胞进行压力加载。在压力加载前，将细胞在三维仿生水凝胶中培养4h，将细胞凝胶置于BioPres压缩培养板中，在计算机上调整压力参数，包括压缩强度和干预时间。　　3、压力加载下对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的观察:　　将2D和3D培养的肝癌细胞分别以不同的压力值（0mmHg，5mmHg，15mmHg，30mmHg，60mmHg）加载一定时间(0h，12h，24h，48h)。用CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验，细胞划痕实验和Transwell实验分别观察2D培养肝癌细胞在不同压力加载条件下的增殖、迁移和侵袭能力;用流式细胞周期技术和RT-qPCR检测观察3D培养肝癌细胞压力下的增殖和转移能力。　　4、压力应答miRNA的筛选及其靶基因的验证:　　mRNA表达谱芯片和miRNA表达谱芯片检测将最适压力加载条件下3D培养的HepG2细胞与未加压的3D培养对照组进行比较，找出差异表达的miRNAs和mRNAs，并通过RT-qPCR在2D和3D培养的HepG2细胞和Huh-7细胞中对芯片结果分别进行验证。通过miRDB、miRTarBase、TargetScan三个数据库预测压力应答miRNA的靶基因列表。通过Gene ontology(GO)和KEGG数据库对靶基因的功能进行富集分析。并利用TargetScan数据库预测筛选出的压力应答miRNA与预测靶基因结合位点，通过荧光素酶报告基因验证两者的靶向关系。　　结果：　　1、压力加载下对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的观察:　　CCK-8实验、Transwell实验和划痕实验结果证实，压力加载15mmHg，24h时促进2D培养肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;细胞流式技术周期实验显示15mmHg，24h的压力加载促进3D培养肝癌细胞的增殖能力，而RT-qPCR实验结果显示，以该条件加载肝癌细胞时，4种基质金属蛋白酶MMP1(Matrix metalloproteinase1)，MMP2，MMP7，MMP14的表达显著增加，肝癌细胞转移能力增加。　　2、压力应答miRNA的筛选及其靶基因的验证:　　mRNA表达谱芯片和miRNA表达谱芯片检测15mmHg，24h加载后的3D培养的HepG2细胞与未加载压力的3D培养对照组细胞进行比较，筛选出5个差异miRNAs(fold change＞=1.2，P＜=0.05)，其中压力加载后上调的miRNA有:miRNA-7-5p，miRNA-7641，miRNA-4485-3p;下调的miRNA有:miRNA-630，miRNA-5703;筛选出10150个差异mRNAs(fold change＞=2，P＜=0.05)，其中上调的mRNA有5102个，下调的mRNA有5048个。芯片结果在2D培养和3D培养的细胞中通过RT-qPCR检测得到验证。通过数据库预测的靶基因与mRNA芯片筛选出的差异基因取交集，将交集基因通过GO和KEGG通路富集分析，筛选出Focal adhesion通路、PI3K(phosphatidylinositol3-kinase)通路和FoxO(forkhead box O)通路可能与压力下肝癌细胞增殖、迁移和侵袭相关，三个通路的焦点蛋白为Src(sarcoma gene)，它也是压力应答miRNA-5703的预测靶基因，在TargetScan数据库预测miRNA-5703与SRC的结合位点，并通过荧光素酶报告基因验证了两者的靶向关系。　　3、压力及压力应答miRNA-5703在肝癌细胞增殖、迁移和侵袭中的分子机理的研究:　　利用CCK-8、Transwell和细胞流式技术发现压力下过表达miRNA-5703后肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力被抑制。通过Western-blotting实验发现15mmHg压力促进了Src、FAK(focal adhesion kinase)、PI3K、SGK3(serum/glucocorticoid regulated kinase3)、PDK1（Phosphoinositide-dependent kinase-1）蛋白表达，抑制了FOXO1和p27Kip1蛋白表达，这与芯片结果加压15mmHg后的HepG2细胞中SRC、PTK1(protein tyrosine kinase1)、PIK3R1、SGK3表达上调，FOXO1和CDKN1B表达下调相符。15mmHg压力促进pSrc(Y418)、pFAK(Y397)、pPDK1(S241)、pSGK3(T320)、pFOXO1(T24)的表达。通过对加压后肝癌细胞应用抑制剂HerbimycinA、GSK2256098、LY294002、PHT-427和EMD638683，证明了Src-FAK-PI3K-SGK3-FOXO1轴与压力促进肝癌细胞的增殖机制有关，Src-FAK-paxillin轴与压力促进肝癌转移的机制有关。通过黏着斑染色证明过表达miRNA-5703抑制加压后肝癌细胞中的vinculin表达;通过细胞骨架染色证明过表达miRNA-5703使加压后肝癌细胞中的细胞应力纤维的数量减少。　　4、压力及压力应答miRNA-5703在实验动物中的研究:　　裸鼠皮下成瘤实验后，RT-qPCR检测证实miRNA-5703在未加压细胞形成的癌组织和正常肝组织中表达无差异，加压后的MHCC97H种植形成的癌组织中miRNA-5703表达下调。Western-blotting实验结果显示加压后的MHCC97H种植形成的癌组织中Src表达上调。过表达miRNA-5703的肝癌细胞形成的瘤体重量明显减小。免疫组化实验检测发现过表达miRNA-5703的肝癌细胞形成的瘤体中Ki67表达明显下调，而NM23的表达明显上调，说明肝癌的生长和转移都被抑制。　　结论：　　压力促进肝癌细胞的增殖和转移能力，这一过程可能与黏着斑通路和FoxO通路有关。压力应答miRNA-5703在压力下表达下调，使其靶基因SRC表达上调，从而使Src蛋白表达上调，而Src通过促进FAK、PDK1、SGK3磷酸化，抑制FOXO1磷酸化且抑制p27Kip1蛋白的表达从而抑制Cyclin D1的表达，促进癌细胞增殖;Src也可促进paxillin蛋白表达，增加细胞骨架中应力纤维数量，提高癌细胞运动能力，促进肝癌转移。围手术期对miRNA-5703表达的干预可能可以预防医源性刺激导致的肝癌复发，且压力应答miRNA-5703的发现对伴肝硬化门脉高压的肝癌的药物治疗也提出了新方向。因此，有望通过调节miRNA-5703在机械压力中的表达来控制肝癌的命运，为肝癌的预防和治疗提供强有力的理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分压力对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分压力下肝癌细胞系miRNA和mRNA的表达谱及生物信息学分析

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分压力应答的miRNA-5703下调促进肝癌生长和转移的分子机理的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分压力及压力应答miRNA-5703在实验动物中的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第五部分压力应答miRNA-5703及SRC在临床样本中的验证

前言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 肿瘤生长生物力学的研究进展

在读期间发表或待发表文章及参加课题

致谢