PSME3在尤文肉瘤发生发展中的作用及机制探索

摘要

目的:　　尤文肉瘤约占所有原始恶性骨肿瘤的10％，占所有儿童恶性肿瘤的3％，主要原发于骨骼和肌肉，也可见于软组织。约25％的患者在诊断时可发现已有转移，其中50％转移至肺，其次是骨、骨髓，转移通常预示着预后不良。尤文肉瘤的治疗方法包括化疗，放疗，局部手术切除等，目前这些治疗方法可使局限性尤文肉瘤患者的生存率达到70％，但对于转移性，复发性和难治性的尤文肉瘤，效果欠佳，其患者预后不良。对于尤文肉瘤的临床有效治疗有待更多基础科研的进一步探索。　　PSME3又被称为REGγ，PA28γ，是11s蛋白酶体激活因子家族的一员。PSME3可以通过泛素非依赖和ATP非依赖途径降解多种蛋白如SRC-3、P16、P19、P21，从而影响细胞周期的调控，在细胞和人类疾病中扮演着重要的角色。研究报道PSME3在甲状腺癌、乳腺癌和直肠癌的血清中高表达，参与多种癌症相关通路条件，在癌症的发生发展中发挥重要作用，但PSME3在尤文肉瘤中的作用与机制尚无文献报道。因此探索PSME3在尤文肉瘤发生发展中的作用与机制，希望为尤文肉瘤的诊疗提供一个新的方向。　　方法:　　1、通过瞬转然后WB和qPCR检测来观察尤文肉瘤细胞SKNMC对PSME3的敲减与过表达处理是否敏感。　　2、通过包病毒构稳转株，验证其敲减效果，进一步研究PSME3敲减对尤文肉瘤细胞SKNMC增殖、迁移功能的影响。　　3、探寻Hippo信号通路是否参与PSME3对尤文肉瘤细胞SKNMC的调控。　　4、采用裸鼠皮下荷瘤来验证PSME3敲减对SKNMC在体内水平是否发挥同样作用。　　5、对尤文肉瘤患者组织标本进行免疫组化染色并根据PSME3表达水平分组，分析PMSE3表达水平与患者预后之间的关系。　　结果:　　首先，通过瞬转后WB和qPCR检测，发现尤文肉瘤细胞株SKNMC对PSME3的敲减与过表达处理敏感。其次，包慢病毒构建稳转株并利用WB检测和qPCR检测来验证其敲减效果，证明PSME3敲减尤文肉瘤稳转细胞株构建成功;然后通过MTT实验和克隆形成实验，发现PSME3敲减抑制尤文肉瘤细胞SKNMC的增殖;通过Transwell小室迁移实验和细胞划痕实验，发现PSME3敲减抑制尤文肉瘤细胞SKNMC的迁移。采用WB检测发现PSME3敲减后lats1的表达水平显著增加，验证尤文肉瘤细胞中PSME3对Hippo信号通路具有调控作用。接着，构建裸鼠皮下荷瘤模型，发现PSME3敲减后形成的肿瘤无论数量还是体积都小于对照组;进一步组织取蛋白样WB检测，证明PSME3在哺乳动物体内可以调控Hippo通路影响尤文肉瘤细胞增殖。最后，对人的尤文肉瘤组织标本进行免疫组化染色，发现PSME3表达水平与尤文肉瘤患者生存时间呈负相关。　　结论:　　基于以上研究结果，认为PSME3在尤文肉瘤的发生发展中发挥着重要作用，PSME3敲减可以抑制体外尤文肉瘤细胞SKNMC的增殖和迁移能力。机制初步探索证明在尤文肉瘤细胞中PSME3对Hippo信号通路具有调控作用。其在哺乳动物体内同样具有调控作用，通过敲减PSME3可以抑制尤文肉瘤细胞SKNMC的生长。人尤文肉瘤组织免疫组化染色发现PSME3表达水平与尤文肉瘤患者生存时间呈负相关。这些研究结果将为尤文肉瘤的诊疗提供新的方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、研究背景

二、课题总体设计

第一部分检测尤文肉瘤细胞中PSME3的敲减与过表达

一、实验主要材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第二部分PSME3敲减在尤文肉瘤细胞发生发展中的作用研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第三部分PSME3敲减抑制尤文肉瘤细胞增殖的机制探索

一、材料和方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第四部分动物实验验证PSME3通过Hippo通路调控尤文肉瘤细胞增殖

一、材料和方法

二、实验结果

三、小结与讨论

第五部分PSME3表达水平与尤文肉瘤患者预后关系研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、小结与讨论

总结与展望

参考文献

文献综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢