肝癌细胞调控肺上皮细胞Chi3l1分泌促进肝癌肺转移的作用和机理研究

摘要

目的：　　原发性肝癌是全球第五大常见恶性肿瘤，其发病率高，且具有易复发易转移的特点，是引起肿瘤相关性死亡的三大恶性肿瘤之一。其中侵袭和转移是造成肝癌患者死亡的主要原因，而肺转移是最常见的转移类型。然而，肝癌肺转移的具体发生机制目前尚不明确，在临床上也缺乏有效的转移标志物和治疗手段。因此研究肝癌肺转移的具体机制，寻找合理特异的转移筛查标志物，发现新的治疗干预靶点，对于优化肝癌临床治疗策略，提高患者生存率，具有重要意义。　　肿瘤转移是一个多阶段、受多因素调控的过程。目前研究发现，肿瘤的远处器官转移受肿瘤细胞和转移脏器微环境的相互作用的驱动，肿瘤细胞通过“教化”远处转移器官的细胞形成利于肿瘤细胞定植生长的“转移前微环境”，为肿瘤细胞转移提供了肥沃的“土壤”。在肿瘤肺转移的过程中，肺上皮细胞作为肺部广泛存在的基质细胞，其在肺部“转移前微环境”的形成中发挥重要基础性的作用。肺上皮细胞可通过多种方式激活，释放多种细胞因子和趋化因子，引起下游信号通路异常激活，导致持续的慢性炎症反应，利于肿瘤的定植，从而促进肺转移的发生。然而，在肿瘤“转移前微环境”的形成过程中，肿瘤细胞与转移器官细胞的交互需要一定的媒介介导。除了细胞因子、生长因子等介质外，外泌体作为携带生物信号的微小囊泡，近年来成为研究体内信息传递的热点。体内大部分细胞可分泌外泌体，其内含有蛋白、RNA、脂质等参与生物信息传递，而肿瘤细胞可分泌大量外泌体，介导肿瘤细胞和基质细胞的交互作用，促进“转移前微环境”的形成，此外，外泌体表面整合素的表达搭配还可介导肿瘤器官特异性转移的发生。因此研究肝癌进展中肺部微环境和重要分子的变化对于理解和防治肝癌肺转移至关重要。　　Chi3l1，是一种分泌型糖蛋白，又叫YKL-40、BRP39，由CHI3L1基因编码，可由多种不同细胞分泌，例如肺上皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等，是参与肺部炎症反应的重要分子。研究发现，Chi3l1表达水平与多种肺部慢性炎症疾病具有相关性。《新英格兰医学》杂志2007年报道了Chi3l1的水平与哮喘的严重程度密切相关，且可作为哮喘严重程度的判断指标和生物学标志物。同时，Chi3l1除了介导慢性炎性疾病的进程，在肿瘤的发生发展中也发挥重要的促进作用。目前已发现，多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、大肠癌、黑色素瘤、胶质细胞瘤，包括肝癌，都存在Chi3l1表达上的升高，并且在乳腺癌和黑色素瘤的研究中发现，Chi3l1可以通过诱导生长因子和血管生成因子的作用促进其肺转移灶的形成。Chi3l1可与多种炎症因子产生交互作用，在局部微环境炎性状态的维持和发展中起关键促进作用，并且其加速血管新生的作用也使其与肿瘤转移关系密切。同时，Chi3l1作为肺“转移前微环境”促进因素在乳腺癌荷瘤小鼠中的作用初步得到鉴定。然而，Chi3l1被诱导分泌及其在肿瘤转移中的作用及机制尚不明确，其在肝癌发展和转移的研究还处于初步阶段，因此阐明Chi3l1在肝癌肺转移的具体作用和机制对于理解肝癌肺转移的过程并且寻找新的干预靶点，具有重要的临床意义。　　本研究旨在阐明Chi3l1在肝癌肺转移过程中发挥的具体作用，研究其对于肺“转移前微环境”形成的促进作用，以及肝癌细胞介导Chi3l1分泌的生物学机制，深入理解肝癌肺转移的具体过程，评估Chi3l1作为肝癌肺转移血清学标志物的潜在应用价值，为临床肝癌肺转移的干预治疗提供新的靶点和思路。　　方法：　　1、临床上收集肝癌肺转移患者、门脉癌栓患者、无转移肝癌患者以及健康人对照血清样本，ELISA检测比较血清中Chi3l1含量差异。　　2、在动物实验中模拟临床分组，在裸鼠中用Hep1-6肝癌细胞建立肝原位肝癌模型和肝癌肺转移模型以及生理盐水裸鼠对照，ELISA检测比较血清中Chi3l1含量差异。　　3、取以上三组不同处理裸鼠组肝、肺、脑、脾、肾、大肠多种器官，免疫组化检测自健康状态——肝癌——肝癌肺转移演变下各器官中Chi3l1表达的变化。　　4、研究Chi3l1对肝癌肺转移的生物学作用，通过利用人Chi3l1重组蛋白处理不同肝癌细胞和建立Chi3l1过表达细胞系的方法，Transwell检测细胞迁移侵袭能力变化，RT-PCR及WB检测间质-上皮转化MET指标变化，RT-PCR和成球实验检测肝癌细胞干性变化。　　5、研究Chi3l1在肺“转移前微环境”形成中的作用。主要检测对血管新生和肺“转移前微环境”特征基因表达的影响。人Chi3l1重组蛋白处理HUVEC细胞，检测对血管新生过程中血管内皮细胞迁移能力的影响，在肝癌细胞系PLC/PRF/5和HCC-LM3中建立Chi3l1过表达细胞系及相应的对照细胞系，裸鼠体内皮下荷瘤，免疫组化检测瘤内血管新生情况差异，并对Hep1-6模型中差异表达Chi3l1的肺组织内血管新生情况进行检测。在Chi3l1不同表达水平的肺组织中检测对肺“转移前微环境”特征基因表达的影响。　　6、选取四种常见的肝癌细胞系通过体外细胞迁移侵袭实验和体内尾静脉注射肺转移模型构建，将四种肝癌细胞系分为高转移组和低转移组。通过收集不同组肝癌细胞培养上清加入到肺上皮细胞Beas2B中，ELISA检测不同肝癌细胞上清处理后肺上皮细胞分泌Chi3l1的变化情况。　　7、分别用高低转移组肝癌细胞在裸鼠体内建立皮下荷瘤、肝原位肝癌、尾静脉注射肺转移模型，并设立相应假处理对照组，分别比较三种模型下肝癌细胞对Chi3l1表达的影响，比较血清中Chi3l1含量的变化，肺切片免疫组化Chi3l1表达情况。　　8、通过提取不同肝癌细胞上清中的外泌体，体外加入肺上皮细胞中，检测其对肺上皮细胞分泌Chi3l1的作用，体内尾静脉注射裸鼠体内，检测对肺部Chi3l1表达的影响。　　9、检测肝癌细胞外泌体对裸鼠肺转移灶形成的影响，通过尾静脉注射SMMC-7721肝癌细胞建立裸鼠肺转移模型，并分组给予高低转移组肝癌细胞外泌体处理，观察对肺转移灶形成能力的影响和肺部Chi3l1表达情况变化。　　10、体内外验证Bortezomib对肺上皮细胞分泌Chi3l1的抑制效果，并通过尾静脉肺转移模型评估其对肝癌肺转移的治疗作用。　　结果：　　1、临床上肝癌肺转移患者血清中Chi3l1水平显著高于门脉癌栓患者、普通无转移肝癌患者及健康人对照。　　2、裸鼠模型模拟临床分组中发现肝癌肺转移组血清Chi3l1水平高于原位肝癌和对照组，并且在肝癌肺转移过程中，肺部Chi3l1表达显著升高。　　3、Chi3l1可以提高肝癌细胞侵袭迁移能力和肝癌细胞间质-上皮转化MET，促进在肺部的定植能力，并且可以增强血管新生，上调肺“转移前微环境”特征性分子表达，促进肺“转移前微环境”形成，从而促进肝癌肺转移发生。　　4、肝癌细胞可促进肺上皮细胞分泌Chi3l1，高转移能力的肝癌细胞促进肺上皮细胞分泌Chi3l1的能力更强。　　5、肝癌细胞来源的外泌体促进肺上皮细胞分泌Chi3l1，且高转移肝癌细胞来源的外泌体具有更强的促分泌能力。　　6、Bortezomib可以体内外有效抑制肺上皮细胞分泌Chi3l1，减少肺转移灶形成。　　结论：　　本研究首先发现在临床肝癌肺转移患者血清中Chi3l1水平显著升高，通过动物模型模拟肝癌肺转移过程发现肺部Chi3l1特异性表达升高，Chi3l1在肺“转移前微环境”形成中起促进作用，具有促进肝癌细胞肺转移的生物学作用，肝癌细胞可通过外泌体调节肺上皮细胞Chi3l1分泌能力，诱导能力与肝癌细胞转移潜能正相关，并且Bortezomib可通过抑制肺上皮细胞分泌Chi3l1减少肺转移灶形成。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、材料

二、实验主要仪器设备

三、研究方法

实验结果

三、Chi3l1促进肝癌细胞的侵袭迁移和间质-上皮转化

四、Chi3l1促进肺“转移前微环境”的形成

五、肝癌细胞可以促进肺上皮细胞分泌Chi3l1，且与转移潜能呈正相关

六、肝癌细胞来源的外泌体可以促进肺上皮细胞分泌Chi3l1，且外泌体“教化”肺上皮细胞的能力与其来源肝癌细胞的转移潜能正相关

七、Bortezomib可以抑制肺上皮细胞分泌Chi3l1，减少肝癌肺转移灶的形成

分析与讨论

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢