毛孢子菌菌血症治疗策略与阿萨希毛孢子菌氟康唑耐药应对策略的临床与基础研究

摘要

研究目的：　　由于发病率较低，自1975年首次报道至今，毛孢子菌菌血症仍无大样本、系统性的回顾分析和临床对照研究。通过对本院电子病历系统及PubMed数据库40年时间段病例的整理，初步揭示其全球流行病学趋势，并对预后因素和临床治疗策略与患者临床结局的关系进行统计学分析，从而指导临床预后的评判和综合治疗方案的制定。其次，通过对阿萨希毛孢子菌临床株生物膜状态和游离状态的体外联合药敏实验，为导管相关菌血症封管治疗中抗真菌药物的选择提供实验室依据。最后，通过体外、体内诱导实验和临床病例分析的方法，探讨钙调磷酸酶抑制剂对于阿萨希毛孢子菌氟康唑获得性耐药的影响。基于上述临床与基础研究结果，为临床一线医生制定更全面的毛孢子菌菌血症治疗方案提供建议和依据。　　研究方法和结果：　　第一部分毛孢子菌菌血症预后因素分析与治疗策略的临床研究　　基于本院电子病历数据系统及对PubMed数据库（1975年至2014年）纳入185例毛孢子菌菌血症患者，收集重要临床信息并分类统计，并对预后因素和临床治疗方案与患者终末结局之间进行统计学分析。全球报道病例的数量逐年增加;病例前30年主要分布于北美洲和欧洲，后10年主要在亚洲和南美洲。患者平均年龄47岁，但后10年成年人比例有所下降，新生儿、儿童及老年人的比例上升;受累人群始终以男性为主。血液系统疾病是最常见基础病，其中急性白血病占比最高;但后10年急性白血病的比例下降，例如糖尿病、早产及实体肿瘤等其他基础病患者的比例上升。多数患者发病前或发病时，有中性粒细胞减少症、化疗、中心静脉置管、抗生素使用或预防性/经验性抗真菌治疗的病史。59.46％的患者伴有单个深部组织器官或播散性感染，最常累及的部位是肺脏、皮肤、肝脏、肾脏和脾脏。形态学方法结合生化试验(45.41％)是最常用的临床鉴定方法，后10年更多使用分子学鉴定方法。阿萨希毛孢子菌是最常见的毛孢子菌临床分离株(75％)。109例患者出现了负面结局（死亡/病情加重），76例患者则是正面结局（治愈/病情改善）;后10年患者预后较前30年改善不明显。　　单因素分析时，使用抗细菌药物、预防性/经验性抗真菌治疗、伴有细菌菌血症以及未进行菌种鉴定与临床负面结局相关;此外，单纯真菌血症（不伴有侵袭性组织/器官感染）、感染后拔除中心静脉置管以及外周血粒细胞水平恢复正常与临床正面结局相关。前30年，两性霉素B/两性霉素B脂质体是最常用的抗真菌治疗方案;而后10年，唑类抗真菌药成为最常用的治疗方案。尽管唑类抗真菌药广泛应用，但患者的整体预后改善不明显。对抗真菌治疗方案的分析发现:使用伏立康唑或唑类抗真菌药联合两性霉素B治疗与患者正面结局相关;然而，使用两性霉素B治疗与患者负面结局相关。不同治疗方案组间两两比较发现:伏立康唑与两性霉素B、氟康唑与两性霉素B、唑类抗真菌药联合两性霉素B与两性霉素B的临床结局差异具有统计学意义;而其他抗真菌治疗方案之间临床结局的差异没有统计学意义。　　第二部分阿萨希毛孢子菌临床株（生物膜/游离状态）体外联合药敏研究　　参照CLSI制订的病原酵母菌标准化方案M27-A3，结合棋盘微量肉汤稀释法对16株阿萨希毛孢子菌临床分离株的游离状态，进行三种常用抗真菌药（伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净）的体外联合药敏实验;基于96孔板构建阿萨希毛孢子菌生物膜，并结合棋盘法进行生物膜体外联合药敏实验。游离状态时，两性霉素B联合卡泊芬净显示出最高比例的协同效应(81.25％)。生物膜状态时，伏立康唑联合两性霉素B显示出最高比例的协同效应(87.5％);伏立康唑SMIC90从＞1，024μg/mL下降至64μg/mL，两性霉素B SMIC90从1024μg/mL下降至32μg/mL。　　第三部分钙调磷酸酶抑制剂对阿萨希毛孢子菌氟康唑获得性耐药的影响　　阿萨希毛孢子菌标准株CBS2479分别进行氟康唑梯度浓度联合钙调磷酸酶抑制剂（环孢素A）固定浓度、氟康唑梯度浓度以及环孢素A固定浓度诱导，同时设置空白对照组;诱导阶段每代及诱导终点检测诱导株对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性。经过诱导培养，氟康唑梯度浓度联合环孢素A固定浓度诱导获得的耐药株，氟康唑MIC值上升了8-16倍，伊曲康唑MIC值上升了4-8倍，伏立康唑MIC值上升了2倍;氟康唑梯度浓度诱导获得的耐药株，氟康唑MIC值上升了32倍，伊曲康唑MIC值上升了8-16倍，伏立康唑MIC值上升了2-4倍。耐药株在无药培养基中进行连续传代后发现，随着传代次数的增多，联合组耐药株对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑MIC值恢复或接近初始状态;而氟康唑单药组耐药株的耐药表型稳定。　　使用环磷酰胺对实验小鼠进行定期免疫抑制，制备标准株CBS2479菌悬液进行鼠尾静脉接种，从而构建氟康唑干预下的阿萨希毛孢子菌持续感染模型。分组进行腹腔内药物注射:氟康唑联合环孢素A、氟康唑、环孢素A和空白对照;记录小鼠生存情况，取心脏、肺脏、肝脏及肾脏进行培养和组织病理检测（HE及亮绿染色）并对分离菌株检测氟康唑敏感性。经过氟康唑体内干预，氟康唑单药组中90％分离株的氟康唑MIC值出现不同程度升高（2-4倍），而氟康唑联合环孢素A中仅有60％分离株的氟康唑MIC值上升2倍。对体内诱导获得的MIC值升高菌株进行免疫抑制小鼠接种并检测氟康唑敏感性。氟康唑联合环孢素A组菌株体内传代后最终氟康唑MIC值基本恢复初始状态，而氟康唑单药组菌株基本稳定。　　病例来源同第一部分，对明确诊断为血液系统疾病且接受骨髓移植后出现毛孢子菌菌血症的病例资料进行汇总分析，获得19例患者，14例未接受氟康唑或伏立康唑抗真菌治疗的患者全部死亡。接受氟康唑或伏立康唑抗真菌长周期治疗的5例患者中，4例患者的抗排异治疗方案中使用了钙调磷酸酶抑制剂（3例使用环孢素A、1例使用他克莫司），上述4例患者都最终痊愈;而使用环磷酰胺联合氟达拉滨作为抗排异治疗方案的患者死亡。　　研究结论：　　第一部分病例一患者持续接受大剂量的糖皮质激素治疗，且同时存在其他危险因素导致继发毛孢子菌菌血症。由于接受卡泊芬净经验性抗真菌治疗药物，而伏立康唑应用不及时;且对于导管管理未给予针对性措施，最终预后不良。这提示目前毛孢子菌菌血症的临床治疗仍存在大量有待解决的问题，包括:患者预后的评估、治疗药物的选择和导管管理的具体措施仍有待解决。病例二患者由于存在的特殊遗传背景，14年间病情不断反复、不规范服用唑类药物，菌株出现对氟康唑耐药，提示对于需要长期使用唑类药物治疗的毛孢子菌病患者，需要制定更为全面、科学的治疗策略，从而避免或减少诱导耐药的发生。　　自1975年首次报道以来，全球毛孢子菌菌血症病例的数量逐年增加;报道从北美洲和欧洲逐渐扩展至亚洲和南美洲，累及人群从成年人扩展至新生儿、儿童和老年人。血液系统恶性肿瘤仍是最常见基础病，但其他更多类型的基础病占比上升;低中性粒细胞血症、中心静脉置管、抗生素使用、化疗以及预防性/经验性抗真菌治疗是患者发生毛孢子菌菌血症的主要危险因素，但近年来患者的基础状态更为复杂，对临床诊疗工作提出更多挑战。尽管在近年来唑类抗真菌药广泛应用，但患者的整体预后改善不明显。　　使用抗生素、预防性/经验性抗真菌治疗、中心静脉置管未拔除、伴有细菌菌血症或侵袭性组织/器官感染，以及未进行菌种鉴定时，毛孢子菌菌血症患者预后不良。伏立康唑可有效改善患者预后;如果临床无法获取伏立康唑，可考虑使用氟康唑联合两性霉素B的治疗方案，患者病情稳定后氟康唑单药治疗。如果伴有持续低中性粒细胞血症，建议调整免疫抑制剂治疗方案，配合给予粒细胞集落刺激因子或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，促进患者外周血粒细胞水平的恢复。此外，对于导管相关毛孢子菌菌血症，建议在临床条件允许的情况下拔除中心静脉置管，从而改善患者预后。　　第二部分第一部分的临床研究发现，毛孢子菌菌血症患者较大比例为导管相关菌血症，该类感染属于生物膜相关感染;前一部分的研究结果也证实拔除导管可改善患者预后。但如果患者现有导管无法拔除时，需要考虑进行封管治疗。本部分的研究证实，所有抗真菌药单药对毛孢子菌生物膜的抑制活性都不强（单药SMIC高于既往封管液推荐浓度），所以不推荐单独作为封管液用于阿萨希毛孢子菌导管相关菌血症的封管治疗;而伏立康唑联合两性霉素B的协同效应最好，联合后两种药物的SMIC均出现显著降低（达到封管液推荐药物浓度）。因此，该组合是导管相关阿萨希毛孢子菌菌血症封管液的最佳选择，特别是对于那些依赖留置导管或拔除导管风险较大的重症患者（例如本院的病例一）。　　第三部分第一部分回顾性研究发现，氟康唑是唑类药物中最常用的治疗选择;本部分体外及动物体内实验研究证实，钙调磷酸酶在阿萨希毛孢子菌对氟康唑的获得性耐药中发挥了一定作用，应用钙调磷酸酶抑制剂可部分阻断获得性耐药的发生，且即使出现耐药，该表型在脱离药物应激压力后可出现转复。同时，临床相关系列病例分析发现，对于特定人群具有钙调磷酸酶抑制剂临床直接应用需求。因此，建议对于骨髓移植后同时需要接受抗排异治疗的患者可以考虑选择钙调磷酸酶抑制剂作为抗排异方案配合氟康唑使用;而对于其他需要长期接受氟康唑治疗的阿萨希毛孢子菌感染患者（例如本院的病例二），还需要进一步筛选出病原真菌特异性的钙调磷酸酶抑制剂进行临床应用，从而减少氟康唑长期应用出现临床耐药。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 毛孢子菌菌血症预后因素分析与治疗策略的临床研究

一、引言

二、研究方法

三、研究结果

三、讨论

四、本章小结

第二章 阿萨希毛孢子菌临床株(生物膜／游离状态)体外联合药敏研究

一、引言

二、材料和方法

(一)材料

(二)实验方法

三、实验结果

三、讨论

四、本章小结

第三章 钙调磷酸酶抑制剂对阿萨希毛孢子菌氟康唑获得性耐药的影响

一、引言

二、材料和方法

(一)材料

(二)实验方法

三、实验结果

三、讨论

四、本章小结

全文总结

附录

参考文献

文献综述

在读期间科研与学术工作情况说明

致谢