水下冲击波致大鼠颅脑外伤早期血清生物标记物蛋白组学研究

摘要

目的：　　随着海上军事斗争不断升级，新型水下高爆性武器如水雷、鱼雷、深水炸弹等的威力逐渐显现，该类型武器所产生的冲击波具有传播速度更快、传播距离更远等特点。水下冲击波致颅脑外伤以轻型颅脑损伤为主，轻度脑震荡可以造成长期头痛、精神不振、记忆力下降，然而通常没有神经影像学改变。轻度脑震荡的诊断通常都很主观，通常基于自述的神经症状。并且部分伤员企图掩盖症状或者无法意识到微小的功能以及意识的改变，对于合理的诊断均会造成影响。临床有效的生物标记物的应用为客观地诊断轻度脑震荡或者预测相关症状提供了新思路。　　Label-free蛋白组学技术属于新型非标记差异蛋白质组学技术，其特点是无需对样本进行标记就能够精准高效地定量样本内蛋白质并对其进行显著性差异分析。运用该技术进行水下冲击波致颅脑外伤相关生物标记物的研究，可以为更好的诊治水下冲击波致颅脑外伤带来新思路。　　方法：　　健康成年sd大鼠120只，由北京大学医学部提供。分为正常对照组40只，常规致伤组40只，水下致伤组40只。每组中，30只用于蛋白组学研究，10只大鼠为一个单位，进行3次重复。另外10只，用于免疫组化分析。将大鼠麻醉后置于固定架，打开供氧面罩，用防护材料对该大鼠胸腹部重要脏器进行防护，将大鼠置于水下1m，10g当量TNT爆源位于水池中心爆炸，爆炸后立即取出。观察实验动物状况，12小时以后取用于蛋白组学的大鼠血清，另取鼠脑进行HE染色以及尼氏染色同时取对照组大鼠血清。常规致伤组液压打击颅脑损伤仪以200kap压力打击，12小时后取用于蛋白组学的大鼠血清，取鼠脑进行HE染色以及尼氏染色同时取对照组大鼠血清。将需进行蛋白组学研究的大鼠血清依次完成去血清高丰度样品处理、SDS-PAGE电泳、FASP酶解、高效液相色谱、质谱鉴定、生信步骤。并随机抽取差异蛋白进行ELISA检验，验证蛋白组学分析结果。同时各组送部分鼠脑进行HE及尼氏染色，并进行免疫组化检测。　　结果：　　1、在水下冲击波致伤组中，该组大鼠爆炸后无死亡，呼吸急促，均在2小时以内清醒，醒后四肢抽搐，12小时内嗜睡。　　常规致伤组中大鼠经液压打击后无死亡，能自由活动，进食、水，12小时内有嗜睡现象，反应较对照组迟钝。在对照组中，大鼠的行为及身体状况都处于正常状态。　　2、HE染色结果显示，对照组中细胞核完整清晰，可见清晰的核仁，没有看到核固缩。常规致伤组中可见脑组织结构疏松，血管腔内、蛛网膜下腔内红细胞淤积。水下致伤组中可见神经元崩解，排列紊乱，染色质固缩、边集于核膜。　　3、尼氏染色结果显示对照组中未见尼氏小体减少。常规致伤组中该组尼氏小体较对照组明显减少。水下致伤组中该组尼氏小体较其他两组，减少更为明显。　　4、免疫组化相关结果显示对照组中该组脑细胞TUNEL阳性神经细胞数量未见异常。常规致伤组与水下致伤组均可见形态较为明显的凋亡细胞，可见散在的核固缩，嗜酸样变，部分伴有胞质的浓缩。　　5、水下致伤组与对照组相比，表达上调的差异蛋白有22个，表达下调的差异蛋白有40个。水下致伤组与常规致伤组相比，表达上调的差异蛋白有16个，表达下调的差异蛋白有28个。　　6、蛋白组学结果显示水下致伤组与对照组相比，这些蛋白参与了生殖、代谢过程、免疫系统过程、生长、行为学、细胞增殖、细胞学行为、繁殖行为、生物黏附、信号通路、多细胞有机体反应、发展反应、细胞移动、节律调节、生物学过程的正反馈调节、生物学反应负反应调节、生物学调节、对刺激的反应、定位、多个有机体反应、生物学调节、细胞成分的合成、解毒、包括化学突出传递的突出前过程。按分子反应来区分，分为催化反应相关蛋白、信号传导过程相关蛋白、结构性分子反应相关蛋白、分子运输过程相关但别、分子功能管理蛋白、分子运载能力蛋白、分子结合相关蛋白、抗氧化能力蛋白、分子转运能力蛋白、分子功能管理蛋白以及分子运输能力相关蛋白。这些蛋白分别位于差异蛋白分别位于细胞膜、细胞膜外区域、细胞、细胞连接、膜状小体、大分子复合体、细胞器、其他有机物、其他有机物部分、细胞器部分、细胞膜部分、突触部分、细胞部分以及突触和超分子复合体。　　差异蛋白通过GO富集分析共富集到20个GO条目，参与了血液循环理、系统反应的管理、激素分泌的管理、心跳的管理、激素分泌的正反馈调节、肽类激素的分泌调节、肽类激素的正反馈调节、信号传递、生物学进程，参与了分子适应能力、蛋白连接、醛类酶解活性、白介素1连接能力、果糖连接能力、二磷酸果糖醛缩酶活性等生物分子学反应按细胞成分分类，可分为运输复合体相关蛋白、跨膜运输复合体相关蛋白、神经肌肉接头相关蛋白、电压门控钾离子通道复合体相关蛋白、离子通道复合体相关蛋白以及微管中心结构相关蛋白。　　富集到补体系统、金黄色葡萄球菌感染、百日咳、血管平滑肌收缩、碳代谢、糖原合成/糖异生、cGMP-PKG信号传导通路、疟疾、磷酸戊糖途径、结核、血小板活动、非洲椎体虫病通路、氨基酸的生物合成、系统性红斑狼疮、亨廷顿病、果糖和甘露糖代谢、流体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路。其中，cGMP-PKG信号通路、磷酸戊糖途径、血管平滑肌收缩、n-glycan生物合成这四个通路最为突出。　　水下致伤组与常规致伤组相比，差异蛋白主要参与了生殖、代谢过程、细胞死亡、免疫系统调节、生长、行为学、细胞增殖、细胞功能调节、生殖功能调节、生物学黏附、信号传导、多细胞有机体调节、分化调节、细胞运动、节律性调节、生物学反应的正反馈调节、生物学反应的负反馈调节、生物学反应的调节、对刺激的反应、定位功能、多器官调节、生物学管理、细胞成分的聚集和合成以及解毒作用等生物学过程。参与了催化反应、结构分子反应、转运体反应、分子连接、抗氧化反应、分子转运反应、分子调节功能以及转录调节等分子活动。按细胞成分分为细胞膜相关蛋白、细胞外区域相关蛋白、细胞自身相关蛋白、细胞连接相关蛋白、膜包围内腔相关蛋白以及大分子复合体相关蛋白。　　根据KEGG结果，富集到糖原合成/糖异生、碳代谢、氨基酸的生物合成、甲状腺激素的合成、病毒相关致癌过程、糖原信号传递系统、补体系统、吞噬体系统、氮代谢、朊病毒疾病、果糖和甘露糖代谢、HIF-1信号传导通路、癌症过程中中心碳代谢、军团病、近端小管碳酸氢根离子的重新收、PI3K-Akt信号传导通路、人类乳头瘤病毒感染以及百日咳等通路。其中包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氮代谢、抗原的处理与呈递、糖原信号传递系统、果糖和甘露糖重吸收、氨基酸的生物合成、糖原合成/糖异生、甲状腺激素合成最为突出。随机抽取差异蛋白进行ELISA验证，与聚类分析结果保持一致。　　结论：　　1、SBDP145、Tau蛋白、磷化Tau蛋白等作为初步筛选得到的差异蛋白相关代谢产物，可以深入研究其生物学效应。　　2、考虑cGMP通路、磷酸戊糖途径以及甲状腺激素合成通路在脑外伤后细胞凋亡和应对缺氧环境的保护机制中起到了重要作用，应进一步继续研究。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

一、实验器材及试剂

二、实验步骤

实验结果

一、一般情况

二、HE染色结果

三、尼氏染色结果

四、免疫组化相关结果

五、蛋白组学研究结果

六、差异蛋白的验证

讨论

一、水下冲击波致脑外伤相关生物标记物研究现状

二、蛋白组学在水下冲击波致颅外伤生物标记物中的应用

三、有关差异蛋白及信号通路的相关讨论

结论

参考文献

附录

综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢