基于高通量功能细胞库筛选的新型选择性激酶小分子抑制剂的发现及生物机制研究

摘要

蛋白激酶的功能获得性突变或过度表达是导致癌症的重要因素之一。近年来，针对蛋白激酶的小分子抑制剂研究也逐渐成为抗癌药物研究中备受瞩目的方向，特别是2001年Imatinib在临床试验上所取得的巨大成功，使得激酶抑制剂作为一类靶点明确，毒副作用较轻的新型抗癌药物迅速跻身于抗癌治疗的一线药物中。然而随着激酶抑制剂在临床上的大规模应用，它们的局限性也不断显现出来，如选择性不高而导致的脱靶性毒副作用及长期用药后产生的获得性耐药等问题。因此，开发选择性高，能克服耐药性突变的新型小分子激酶抑制剂具有重要的基础研究意义和临床应用价值。此外，尽管目前已经发现了将近530种蛋白激酶，但是许多蛋白激酶在人体内的生理和病理功能尚不明确，发展针对这些激酶的高选择性小分子抑制剂将有助于人们揭示这些激酶的新的作用机制并发现新的疾病治疗靶点。
　　本研究基于以激酶为靶点的BaF3功能细胞库，采用高通量筛选的方法，发现了5个新型选择性激酶抑制剂: CHMFL-110，CHMFL-74，CHMFL-155，CHMFL-159，和STK16-IN-1。在经过一系列体内外药效学评价后，我们发现:(1) CHMFL-110是一个靶向c-KIT激酶的高选择性抑制剂，和已批准上市的c-KIT抑制剂Imatinib和Sunitninb相比，能够完全摒除对ABL和FLT3激酶的脱靶效应，并对胃肠间质瘤细胞GIST-T1和GIST-882的增殖具有明显的抑制作用(GI50分别为0.021μM和0.043μM)。在动物模型体内，CHMFL-110表现出良好的药代动力学性质和抗肿瘤活性，有进一步开发成为治疗胃肠间质瘤药物的潜力。(2)CHMFL-074是靶向Bcr-Abl激酶的选择性抑制剂，它不仅对Bcr-Abl靶点的抑制作用比Imatinib强(IC50∶25nM)，而且能够克服Imatinib耐药性突变E255K，F317I，F317L，M351T，Q252H，Y253F和F369P，对Bcr-Abl阳性病人原代细胞的增殖和动物模型体内肿瘤的生长都有较强的抑制效果，是一个有望应用于慢性髓细胞性白血病的新型激酶抑制剂。(3)CHMFL-155与CHMFL-74的结构类似，但我们发现，该化合物不仅对Bcr-Abl靶点活性较高(IC50∶46nM)，对c-KIT靶点也有较强的抑制作用(IC50∶75nM)，且口服吸收效果良好，可作为Bcr-Abl/c-KIT抑制剂进行慢性髓细胞白血病和胃肠间质瘤两个方向的药物开发。(4) CHMFL-159是一个靶向PDGFRα的高选择性抑制剂，不仅对结构与PDGFRα类似的其他激酶如ABL、c-KIT、FLT3、VEGFR等没有抑制作用，对PDGFRβ也有近44倍的选择性差异。在PDGFRα依赖性细胞模型EOL-1上，低浓度的CHMFL-159就能够明显抑制细胞增殖及PDGFRα介导的信号通路，在动物模型体内，CHMFL-159(100mg/kg/d)的抑瘤率达到100％，是研究PDGFRα生理和病理功能的有利工具，并有望应用于PDGFRα相关的肿瘤治疗上。(5) STK16-IN-1是针对目前研究较少的STK16激酶开发的高选择性抑制剂（IC50∶0.295μM），我们以它作为药理学研究工具发现在乳腺癌细胞MCF-7中，抑制STK16会引起双核细胞的增多和G2/M期细胞周期阻滞。在将STK16基因沉默后，我们也发现了相同的现象。这一研究结果初步揭示了STK16激酶在细胞有丝分裂中的作用，也为下面进一步研究STK16的生理或病理功能奠定基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 临床上已上市的激酶抑制剂所存在的问题

1．1．1 激酶抑制剂的毒副作用问题

1．1．2 激酶抑制剂的耐药性问题

1．2 针对激酶靶点的BaF3功能细胞库简介

1．2．1 针对激酶靶点的BaF3功能细胞的构建原理和方法

1．2．2 针对激酶靶点的BaF3功能细胞库的种类和目前的规模

1．2．3 针对激酶靶点的BaF3功能细胞库的特点和优势

1．3 高通量筛选BaF3功能细胞库对于开发新型选择性激酶小分子抑制剂的意义

第2章 针对c-KIT激酶靶点的选择性激酶抑制剂的发现和生物机制研究

2．1 研究背景

2．2 实验结果

2．2．1 CHMFL-110的发现

2．2．2 CHMFL-110体外酶活研究和选择性分析

2．2．3 CHMFL-110对c-KIT依赖性GIST细胞系的抗增殖作用研究

2．2．4 对CHMFL-110与c-KIT激酶蛋白的结合模式的研究

2．2．5 CHMFL-110对GIST细胞系信号通路和细胞周期的影响

2．2．6 CHMFL-110的药物代谢动力学研究和对皮下移植瘤小鼠模型的抗肿瘤活性研究

2．3 结果分析与讨论

2．4 实验材料和方法

2．4．1 细胞系

2．4．2 主要试剂和仪器

2．4．3 化学合成路线

2．4．4 CHMFL-110与c-KIT和ABL激酶的分子对接

2．4．5 蛋白样品的制备

2．4．6 CHMFL-110对信号通路的影响

2．4．7 体外激酶生化测试

2．4．8 BaF3功能细胞的构建

2．4．9 化合物与激酶亲和能力(Kd)及其激酶谱选择性评价实验(KINOMEscanTM)

2．4．10 细胞凋亡实验

2．4．11 细胞周期实验

2．4．12 CHMFL-110对细胞增殖的影响

2．4．13 大鼠体内药代动力学实验

2．4．14 Balb／c-nu小鼠移植瘤模型实验

2．4．15 免疫组织化学

第3章 针对Bcr-Abl激酶靶点的新型激酶抑制剂的发现和生物机制研究

3．1 研究背景

3．2 实验结果

3．2．1 CHMFL-074和CHMFL-155的发现

3．2．2 CHMFL-074体外酶活研究和选择性分析

3．2．3 CHMFL-074与ABL1结合模式的研究

3．2．4 CHMFL-074对Bcr-Abl依赖性CML细胞系和Bcr-Abl阳性病人原代细胞的抗增殖作用研究

3．2．5 CHMFL-074对CML细胞系信号通路和细胞周期的影响

3．2．6 CHMFL-074对皮下移植瘤小鼠模型的抗肿瘤活性

3．2．7 CHMFL-155的体外酶活研究和选择性分析

3．2．8 CHMFL-155与ABL1和c-KIT结合模式的研究

3．2．9 CHMFL-155对Bcr-Abl依赖性CML细胞系和c-KIT依赖性GIST细胞系的抗增殖作用研究

3．2．10 CHMFL-155对CML细胞系和GIST细胞系信号通路和细胞周期的影响

3．2．11 CHMFL-155的药物代谢动力学研究和对皮下移植瘤小鼠模型的抗肿瘤活性研究

3．3 结果分析与讨论

3．4 实验材料和方法

3．4．1 细胞系

3．4．2 主要试剂和仪器

3．4．3 化学合成路线

3．4．4 共结晶和结构解析

3．4．5 体外激酶生化测试

3．4．6 BaF3功能细胞的构建

3．4．7 抗增殖活性的测定

3．4．8 克隆集落实验

3．4．9 信号通路影响的测定

3．4．10 细胞凋亡实验

3．4．11 细胞周期实验

3．4．12 病人原代细胞的纯化

3．4．13 CML病人原代细胞抗增殖活性的检测

第4章 针对PDGFRα激酶靶点的选择性激酶抑制剂的发现和生物机制研究

4．1 研究背景

4．2 实验结果

4．2．1 CHMFL-159的发现

4．2．2 CHMFL-159的体外酶活研究和选择性分析

4．2．3 CHMFL-159与PDGFRα结合模式的研究

4．2．4 CHMFL-159对PDGFRα依赖性和高表达性癌细胞系的抗增殖作用

4．2．5 CHMFL-159对PDGFRα信号通路的影响

4．2．7 CHMFL-159的药物代谢动力学研究和对皮下移植瘤小鼠模型的抗肿瘤活性研究

4．3 结果分析与讨论

4．4 实验材料和方法

4．4．1 细胞系

4．4．2 主要试剂和仪器

4．4．3 化学合成路线

4．4．4 PDGFRα的蛋白纯化

4．4．5 共结晶及结构解析

4．4．6 体外激酶生化测试

4．4．7 BaF3功能细胞的构建

4．4．8 抗增殖活性的测定

4．4．9 信号通路影响的测定

4．4．10 细胞凋亡实验

第5章 针对STK16激酶靶点的选择性激酶抑制剂的发现和生物机制研究

5．1 研究背景

5．2 实验结果

5．2．1 STK16-IN-1的体外酶活研究和选择性分析

5．2．2 对STK16-IN-1与STK16激酶结合机制的研究

5．2．3 STK16-IN-1在肿瘤细胞内对STK16的抑制活性研究

5．2．4 对STK16相关细胞内信号通路的作用机制探讨

5．2．5 对STK16协同抗增殖作用的探讨

5．2．6 STK16在细胞有丝分裂中的作用

5．3 结果分析与讨论

5．4 实验材料和方法

5．4．1 细胞系

5．4．2 主要试剂和仪器

5．4．3 化学合成路线

5．4．4 STK16，4EBP1和DGR1的蛋白纯化

5．4．5 体外激酶生化测试

5．4．6 ATP竞争性实验

5．4．7 STK16-IN-1与STK16激酶的分子对接

5．4．8 Hela-STK16-GFP-Flag稳转细胞系的构建

5．4．9 STK16的RNA干扰实验

5．4．10 免疫共沉淀实验

5．4．11 免疫荧光染色

5．4．12 抗增殖活性的测定

5．4．13 信号通路影响的测定

5．4．14 细胞凋亡实验和细胞周期分布实验

5．4．15 药物组合实验

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果