miR-155-5p调控巨噬细胞极化在HTG-AP重症化中的作用及机制研究

摘要

研究背景和目的　　近年来，高甘油三酯急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis，HTG-AP)发病率呈逐年上升。较其它诱因引发的AP而言，HTG-AP具有并发症多、易重症化、预后相对更差等特点，因此积极探究HTG-AP重症化的可能机制，并在此外基础上探索其治疗策略，对于提高HTG-AP患者的预后具有重要意义。　　研究表明，机体免疫失衡引发的全身炎症风暴是导致AP病情进展的重要环节。巨噬细胞作为一类重要的固有免疫细胞，是AP炎症风暴中炎症因子的主要来源，其具有高度可塑性，可根据所处微环境和受到的外界刺激不同，极化并成为具有不同功能特点的细胞亚群，主要的两个亚群为经典活化巨噬细胞，即M1型巨噬细胞，以促进炎症反应为主要功能；以及替代性活化巨噬细胞，即M2型巨噬细胞，发挥抗炎、促进伤口愈合及组织修复等作用。既往研究证实，巨噬细胞极化失衡可显著影响AP病情发展和患者预后，而且调控巨噬细胞极化失衡可有效缓解病情。鉴于高甘油三酯血症导致组织微环境的改变可影响巨噬细胞代谢和功能，那么HTG-AP中巨噬细胞极化平衡是否发生改变？这与HTG-AP的重症化是否有关？这些问题都有待进一步研究。　　基于文献报道和我们前期工作基础，我们发现HTG-AP患者循环miRNA表达谱具有一定特异性。循环miRNA可随血液循环到达全身各处，并被整合进入细胞，进而调控多种细胞活动。大量的研究已证实，miRNA在巨噬细胞极化过程中发挥关键作用，并在多种疾病中影响炎症反应程度。那么，HTG-AP特异表达的miRNA能否通过调控巨噬细胞极化表型进而影响疾病重症化？　　综上，本研究拟明确HTG-AP病程中巨噬细胞的极化状态情况及其影响，并以miRNA为切入点探讨其潜在的调控机制，为深入阐明HTG-AP重症化机制提供实验依据。　　第一部分:巨噬细胞极化失衡在HTG-AP重症化中的作用　　目的：通过构建AP和HTG-AP动物模型，探究巨噬细胞极化表型；并在抑制部分巨噬细胞后观察病情严重程度变化。　　方法：将32只小鼠平均分为control组、HTG组、AP组和HTG-AP四组，对HTG组和HTG-AP组小鼠，腹腔注射P-407诱导高甘油三酯血症；注射雨蛙素对AP组和HTG-AP诱发急性胰腺炎。在HTG-AP模型基础上，尾静脉注射氯化钆可抑制巨噬细胞。造模完成12h后取材，收集血液检测血甘油三酯、胆固醇和淀粉酶，并用CBA多因子检测技术检测血炎症因子浓度；HE染色观察胰腺组织损伤程度并进行病理评分，对胰腺和肝脏进行免疫荧光染色观察巨噬细胞极化状态；腹腔灌洗收集腹腔巨噬细胞，利用qPCR检测极化相关标志物基因mRNA表达水平。　　结果：相比AP组，HTG-AP组胰腺损伤更加严重，血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高，而抗炎因子IL-10明显降低；胰腺和肝脏组织中M1型巨噬细胞比例升高，而M2型巨噬细胞大幅减少；腹腔巨噬细胞M1相关标志物mRNA表达升高，M2相关标志物除Arg-1外其余mRNA表达下降。而抑制巨噬细胞后，胰腺组织损伤得到缓解，血清中抗炎及抗炎细胞因子均下降。这说明HTG-AP小鼠表现出更严重的胰腺损伤和全身炎症水平，巨噬细胞M1极化比例升高；而抑制巨噬细胞后病情缓解。　　第二部分：HTG-AP巨噬细极化失衡机制探究　　目的：筛选HTG-AP状态下差异表达的循环miRNA，并探究该miRNA在体内和体外条件下对巨噬细胞极化的调控作用和对HTG-AP病情严重程度的影响。　　方法：收集HTG-AP和血脂正常的AP患者血清，以及上一部分各组小鼠血清检测miR-145-5p、miR-155-5p和miR-205-5p表达丰度。在HTG-AP动物模型基础上，将小鼠分为miR-155-5pAntagomir和AntagomirNC两组，经尾静脉分别注射miR-155-5pAntagomir和AntagomirNC后，观察胰腺损伤和血清炎症因子浓度，检测胰腺、肝脏和腹腔巨噬细胞极化水平，检测手段与上一部分一致。使用RAW264.7小鼠巨噬细胞系，分为5组，分别设为对照组，AgomirNC、AntagomirNC、miR-155-5pAgomir和miR-155-5pAntagomir组，转染相应的miRNA后与经雨蛙素刺激的小鼠原代胰腺腺泡细胞共培养；6h后收集巨噬细胞提取RNA检测极化相关标志物mRNA水平，提取蛋白利用westernblot检测p-NF-κBp65和NF-κBp65含量。　　结果：miR-155-5p无论是在HTG-AP患者还是小鼠血清中均明显升高。降低HTG-AP小鼠血清miR-155-5p水平后，小鼠胰腺组织损伤和全身炎症水平均得到明显改善，胰腺、肝脏和腹腔组织中M1型巨噬细胞比例升高，但就M2型巨噬细胞而言，虽然肝脏M2巨噬细胞比例升高，但胰腺M2巨噬细胞比例与AntagomirNC组相比无明显变化；腹腔巨噬细胞M1相关标志物mRNA除iNOS外均表达降低，M2相关标志物除IL-10外其余mRNA均表达升高。与腺泡细胞共培养后的巨噬细胞，miR-155-5pAgomir组与AgomirNC组相比M1标志物表达量均升高，而M2标志物表达量均下降，NF-κB信号通路激活；而miR-155-5pAntagomir与AntagomirNC相比则相反，M1标志物表达量均降低，而M2标志物表达量均升高，NF-κB信号通路激活受到抑制。　　全文结论：　　本研究通过泊洛沙姆P-407和雨蛙素联合应用成功构建HTG-AP小鼠动物模型，发现HTG-AP小鼠表现出更重的胰腺组织损伤和全身炎症水平，且胰腺、肝和腹腔内的巨噬细胞M1极化趋势更为明显；而抑制巨噬细胞以后，HTG-AP小鼠的病情严重程度得到改善。相较于AP而言，循环miR-155-5p在HTG-AP状态下丰度更高；降低循环miR-155-5p水平有利于减少巨噬细胞M1极化，并减轻小鼠HTG-AP疾病严重程度。细胞实验也证实，miR-155-5p是巨噬细胞极化调控的关键因素。综上，miR-155-5p通过调控巨噬细胞极化介导HTG-AP重症化。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 高甘油三酯胰腺炎概述

1.2 急性胰腺炎与巨噬细胞

1.2.1巨噬细胞极化的概念与特征

1.2.2 巨噬细胞在急性胰腺炎中的作用

1.3. miRNA 与急性胰腺炎

1.3.1. miRNA概述

1.3.2. AP中miRNA表达谱改变

1.3.3. miRNAs参与AP相关病理生理过程

1.4 主要研究内容

1.5 技术路线

第2章 巨噬细胞极化失衡在HTG-AP重症化中的作用

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2主要实验仪器

2.1.3 主要实验试剂

2.2 实验步骤

2.2.1 动物分组及模型制备

2.2.2 巨噬细胞耗竭

2.2.3 动物取材

2.2.4 血TG和TC检测

2.2.5 血清淀粉酶检测

2.2.6 石蜡切片及HE染色

2.2.7 免疫荧光染色

2.2.8 细胞因子检测

2.2.9 腹腔巨噬细胞总RNA提取

2.2.10 qPCR 反应

2.3 统计学分析

2.4. 实验结果

2.4.1. HTG-AP小鼠表现出更严重的胰腺组织损伤和全身炎症水平

2.4.2 HTG-AP 小鼠巨噬细胞M1 极化比例增加

2.4.3 耗竭肝巨噬细胞可减轻HTG-AP全身炎症水平

2.5 讨论与小结

第3章 HTG-AP巨噬细极化失衡机制探究

3.1 临床资料

3.1.1 研究对象

3.1.2 纳入和排除

3.2 实验材料

3.2.1 实验动物

3.2.2 细胞株

3.2.3 实验仪器

3.2.4 实验试剂

3.3 实验步骤

3.3.1 动物分组及模型制备

3.3.2 取材

3.3.3 原代腺泡细胞分离

3.3.4 巨噬细胞培养

3.3.5 血清miRNA表达量检测

3.3.6 血清miRNAs的逆转录反应

3.3.7 qPCR反应

3.3.8 蛋白提取及Western blot检测

3.3.9 与上一章相同的实验步骤不再重复列出

3.4 统计学分析

3.5 实验结果

3.5.1 血清miRNA表达水平检测

3.5.2 抑制miR-155-5p 水平改善HTG-AP炎症水平

3.5.3 降低血清miR-155-5p抑制巨噬细胞M1 极化

3.5.4 miR-155-5p 调控巨噬细胞极化

3.6 讨论和小结

结 论

致 谢

参考文献

附录:中英文缩略语表

攻读硕士学位期间发表的论文