羟基红花黄色素A联合Lexiscan对脑缺血-再灌注损伤治疗的研究

摘要

药效机理和药物生物分布是影响药效作用的两个重要因素。作为临床药物中的主要成分之一，羟基红花黄色素A(HYSA)的神经保护作用及机制已有大量研究，但其在脑缺血-再灌注(IR)损伤中关于细胞焦亡的机制尚不明确。另一方面，由于HSYA是亲水性药物，血脑屏障(BBB)透过率低，无法发挥药效作用。　　目的：为了研究HSYA对体内外实验中细胞焦亡相关因子NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65的调节作用。同时，为了改善其缺陷，进一步提高HSYA的治疗效果，本研究联用了腺苷受体激动剂Lexiscan(Lex)，探究Lex是否可以通过协助HSYA通过细胞旁路穿过BBB到达病灶部位，以提高HSYA在脑病灶部位的富集，提升HSYA对IR损伤的治疗效果。　　方法：(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用：建立体外氧化应激损伤模型，用MTT法和活/死细胞实验检测HSYA对PC12损伤细胞的体外保护作用；通过qRT-PCR、Western-blot法和ELISA实验，分别从mRNA转录和蛋白表达水平检测HSYA对损伤细胞NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的调节作用；建立大鼠中动脉阻塞(MCAO)模型，系统评价HSYA对大鼠神经行为、脑梗死、脑水肿和组织病理学的影响，并在体内验证HSYA对损伤脑组织中NLRP3，ASC，Caspase-1和GSDMD蛋白的影响。　　(2)Lex联合HSYA(Lex-HSYA)给药对IR损伤的药效研究：通过b.End3细胞、C6细胞共培养，建立体外BBB模型，检测Lex对BBB上P-gp、F-actin蛋白的作用，并用HRP示踪法验证Lex对体外BBB的调节作用；EvansBlue法、内源性IgG蛋白检测分析Lex对药物在脑内滞留时间的影响，并在透射电镜下观察Lex对BBB超微结构的影响；通过小动物活体成像实时监测体内荧光变化，HPLC检测脑内药物实际含量，以探究Lex对药物体内分布的影响；建立大鼠MCAO模型，系统评价Lex-HSYA的药效学作用。　　结果：(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用：HSYA能降低H2O2对细胞的毒性损伤，发挥其保护作用。HSYA给药后，NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18和LDH的mRNA转录水平和蛋白表达量均呈现显著下降趋势，说明HSYA可以抑制细胞焦亡通路。同时，HSYA可以抑制NF-κB信号通路，进而减轻神经细胞损伤。在HSYA的体内药效实验中，相对于Model组，高剂量HSYA给药能够有效抑制NLRP3,ASC,Caspase-1和GSDMD蛋白的表达，降低大鼠脑梗死体积，减少脑组织胞膜破碎、细胞间隙变宽等情况，改善神经损伤，发挥神经保护作用。　　(2)Lex-HSYA对IR损伤的药效研究：成功建立体外BBB模型。Lex能显著减少P-gp蛋白的表达，抑制P-gp在BBB上发挥外排作用；Lex能降低F-actin的表达，使BBB的细胞间隙增大；最后HRP示踪法检测到Lex能使体外BBB透过量显著增加。体内验证中，Lex可以使正常大鼠脑组织皮层渗入EB染料，Lex组内源性IgG蛋白泄漏量和模型组相似，即说明Lex可以增大正常大鼠脑组织BBB通透性；Lex也可以通过改变BBB的超微结构而影响BBB的通透性，以促进药物在脑内的富集。HSYA当量的Cy7染料能实时监测脑中荧光变化，Cy7-Lex组比Cy7组显示出更强的荧光信号且富集时间更长，说明Lex可以增加药物在脑内的浓度和停留时间。HPLC法检测出Lex-HSYA组中HSYA含量更高，即Lex能增加脑内HSYA的浓度。体内药效实验中Lex能促进HSYA在脑内富集，改善组织病理学形态，并促进神经营养因子的产生以减轻脑缺血损伤，增强药物治疗效果。　　结论：HSYA通过抑制IR损伤时NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的表达，发挥神经保护作用，因此，细胞焦亡通路可以作为HSYA在神经损伤治疗中新的治疗靶点。同时，Lex能增加HSYA在BBB内的富集，显著减少脑梗死体积，改善组织病理学形态，并促进神经营养因子的产生，减轻IR损伤，因此Lex-HSYA有望成为神经损伤治疗的候选药物。并且，本研究为血脑屏障调节剂Lex应用于建立跨血脑屏障通道提供了新的证据。

目录

声明

缩略词

第1 章 绪论

1.1 脑缺血-再灌注损伤

1.2.1羟基红花黄色素A的结构及药动学研究

1.2.2羟基红花黄色素A的药理作用及机制

1.2.3 细胞焦亡机制

1.3 血脑屏障及其通透性调节

1.3.1 血脑屏障的结构特点

1.3.2 基于血脑屏障的递药体系分析

1.3.3 A2a 腺苷受体的血脑屏障调节作用

1.4 本课题的研究目的、意义及研究方案

第2 章 羟基红花黄色素A 对脑缺血-再灌注损伤中细胞焦亡通路的调节作用

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物、细胞

2.1.2 药物、试剂

2.1.3 实验仪器、耗材

2.2 实验方法

2.2.1 MTT 法检测HSYA 对PC12神经损伤细胞的保护作用

2.2.2 活/死细胞法检测HSYA 对氧化应激损伤细胞的作用

2.2.3 qRT-PCR 检测焦亡因子的mRNA 转录

2.2.4 ELISA 法和微板法分别检测IL-18 、LDH 蛋白的表达

2.2.5 Western Blot 法检测焦亡蛋白的表达

2.2.6 MCAO 模型建立及药效学评价

2.2.7 统计学分析

2.2.1 HSYA 对 H2O2诱导的PC12 神经损伤细胞的保护作用

2.3.2 HSYA 对焦亡细胞的影响

2.3.3 HSYA 对焦亡因子的mRNA 转录水平的影响

2.3.4 HSYA 对焦亡相关蛋白表达的影响

2.3.5 大鼠神经行为学评价

2.3.6 脑梗死体积和脑含水量测定

2.3.7 组织病理学分析

2.3.8 Western Blot 法分析HSYA 对脑组织焦亡蛋白表达的影响

2.4 讨论

第3 章 Lex-HSYA 对脑缺血-再灌注损伤的药效研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物、细胞

3.1.2 药物、试剂

3.1.3 实验仪器、耗材

3.2.1 体外建立BBB 模型及验证

3.2.2 体外检测Lex 的作用

3.2.3 体内检测Lex 的作用

3.2.4 Lex 对药物体内分布的影响

3.2.5 HSYA- Lex 对MCAO 大鼠的药效作用

3.2.6 统计学分析

3.3.1 体外建立BBB 模型及验证

3.3.2 体外检测Lex 的作用

3.3.3 体内检测Lex 的作用

3.3.4 Lex 对药物体内分布的影响

3.3.5 大鼠神经行为学评价

3.3.6 脑梗死体积和含水量分析

3.3.7 组织病理学分析

3.3.8 HSYA 对脑组织中NGF、BDNF 蛋白表达的影响

3.4 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文