美金刚调节海马棒状结构对CCH大鼠认知受损的作用研究

摘要

研究背景与目的：　　痴呆是导致65岁以上老年人致残的主要原因，至今仍缺乏有效防治措施，严重影响患者的临床救治和预后。随着老龄化人口基数的扩大，痴呆患者人数逐年剧增，给全球公共卫生系统带来巨大挑战。近年来越来越多的研究揭示血管因素是痴呆发病的重要原因，而血管性认知障碍(Vascular cognitive impairment，VCI)相关致病机制的探讨则是进一步揭示血管因素在痴呆发病中的作用和意义的重要手段。　　棒状结构(Cofilin-actin rods，cofilin rods)由丝切蛋白(cofilin)和肌动蛋白微丝(F-actin)以1:1的比例组成，存在于神经元的胞浆和胞核。棒状结构可由多种应激条件诱导形成，是近年来研究的一个焦点。研究表明脑缺血导致NMDA受体持续过度激活，且细胞实验中给予过量的谷氨酸可诱发神经元内棒状结构的形成。研究发现棒状结构在脑缺血性疾病和AD、帕金森(Parkinson's disease，PD)等神经变性疾病的发生发展中起到重要作用，通过阻塞微管运输、引发突触和树突棘的结构损害和功能障碍、破坏线粒体功能，影响神经细胞和大脑的正常生理功能。　　本研究团队的前期工作初步揭示，慢性脑低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion， CCH)可引发实验大鼠持续性认知功能受损，且这种认知受损与大鼠海马棒状结构形成和突触可塑性改变密切相关。美金刚是目前治疗中重度阿尔茨海默病的临床常用药物，但其在血管性认知障碍中的作用尚不明确。因此，本实验在前期研究的基础上，采用选择性NMDA受体拮抗剂美金刚作为CCH大鼠的干预剂，通过观察大鼠的行为学和海马棒状结构的变化，结合相关突触素及超微结构改变，深入探讨海马棒状结构在CCH所致实验动物认知受损的相关机制，进一步探讨血管因素在痴呆发病中的作用机制提供实验依据，为进一步探寻血管性认知障碍防治新靶点提供新思路。　　材料与方法：　　将60只健康成年Sprague-dawley大鼠随机分为4组：颈总动脉不结扎假手术对照组(假手术组)、慢性脑低灌注实验组(CCH组)、慢性脑低灌注美金刚给药组(美金刚组)和生理盐水给药对照组(溶剂对照组)，各组大鼠15只，均为4周组。采用pBCCAO方法建立CCH大鼠模型，美金刚组和溶剂对照组在CCH模型上分别给予每周5次美金刚或生理盐水腹腔注射(2.5 mg/kg)，持续4周。通过旷场实验和Morris水迷宫行为学分析大鼠焦虑样行为与空间学习和工作记忆能力变化特点；通过westernblotting半定量检测海马突触素和丝切蛋白表达水平；通过免疫荧光染色原位标记并用激光共聚焦显微镜量化分析海马CA1区突触素和棒状结构水平变化；通过透射扫描电子显微镜观察突触超微结构完整性变化特点。　　结果：　　1.美金刚对实验动物认知行为的影响：大鼠在旷场实验中的站立次数结果表明，溶剂对照组和CCH组大鼠表现出明显的焦虑样行为(Anxiety-like behavior, ALB)。Morris水迷宫分析结果显示，溶剂对照组和CCH组大鼠出现了空间学习和工作记忆能力受损，而美金刚干预后的CCH大鼠空间学习和工作记忆功能得到明显改善。(1)第1天检测大鼠在旷场实验中的站立次数，结果采用单因素方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的站立次数明显增加(57±16.85vs39.73±12.67，P＜0.05)；与假手术组相比，CCH组大鼠的站立次数显著下降(37.64±14.53vs72.64±19.26，P＜0.001)。(2)第2~6天的空间学习训练结果采用重复测量方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著下降(P＜0.001)；与假手术组相比，CCH组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著增加(P＜0.001)。(3)第7天为定位航行试验，采用单因素方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的逃避潜伏期明显减少(4.67±2.07vs7.64±2.69，P＜0.01)；与假手术组相比，CCH组大鼠的逃避潜伏期明显延长(4.45±1.12vs7.81±3.49，P＜0.01)。(4)一周后，连续4天的工作记忆检测结果显示：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著下降(P＜0.001)；与假手术组相比，CCH组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著增加(P＜0.001)。　　2.美金刚对实验动物海马组织突触素和丝切蛋白水平的影响：CCH组大鼠和溶剂对照组的海马突触素和丝切蛋白水平均有明显下降，而美金刚组大鼠海马突触素和丝切蛋白水平均明显升高。美金刚组与溶剂对照组的突触素水平分别为0.98±0.08vs0.75±0.03，丝切蛋白水平分别为0.9±0.07vs0.75±0.09；CCH组与假手术组的突触素水平分别为0.97±0.03vs0.74±0.03，丝切蛋白水平分别为1.43±0.16vs0.74±0.22。采用独立样本t检验分析结果显示，与溶剂对照组相比，美金刚组突触素与丝切蛋白水平显著升高(P＜0.05)；与假手术组相比，CCH组突触素与丝切蛋白水平显著下降(P＜0.05,P＜0.01)。　　学分析大鼠焦虑样行为与空间学习和工作记忆能力变化特点；通过westernblotting半定量检测海马突触素和丝切蛋白表达水平；通过免疫荧光染色原位标记并用激光共聚焦显微镜量化分析海马CA1区突触素和棒状结构水平变化；通过透射扫描电子显微镜观察突触超微结构完整性变化特点。　　结果：　　1.美金刚对实验动物认知行为的影响：大鼠在旷场实验中的站立次数结果表明，溶剂对照组和CCH组大鼠表现出明显的焦虑样行为(Anxiety-like behavior, ALB)。Morris水迷宫分析结果显示，溶剂对照组和CCH组大鼠出现了空间学习和工作记忆能力受损，而美金刚干预后的CCH大鼠空间学习和工作记忆功能得到明显改善。(1)第1天检测大鼠在旷场实验中的站立次数，结果采用单因素方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的站立次数明显增加(57±16.85vs39.73±12.67，P＜0.05)；与假手术组相比，CCH组大鼠的站立次数显著下降(37.64±14.53vs72.64±19.26，P＜0.001)。(2)第2~6天的空间学习训练结果采用重复测量方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著下降(P＜0.001)；与假手术组相比，CCH组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著增加(P＜0.001)。(3)第7天为定位航行试验，采用单因素方差分析：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的逃避潜伏期明显减少(4.67±2.07vs7.64±2.69，P＜0.01)；与假手术组相比，CCH组大鼠的逃避潜伏期明显延长(4.45±1.12vs7.81±3.49，P＜0.01)。(4)一周后，连续4天的工作记忆检测结果显示：与溶剂对照组相比，美金刚组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著下降(P＜0.001)；与假手术组相比，CCH组大鼠的游泳总行程和逃避潜伏期显著增加(P＜0.001)。　　2.美金刚对实验动物海马组织突触素和丝切蛋白水平的影响：CCH组大鼠和溶剂对照组的海马突触素和丝切蛋白水平均有明显下降，而美金刚组大鼠海马突触素和丝切蛋白水平均明显升高。美金刚组与溶剂对照组的突触素水平分别为0.98±0.08vs0.75±0.03，丝切蛋白水平分别为0.9±0.07vs0.75±0.09；CCH组与假手术组的突触素水平分别为0.97±0.03vs0.74±0.03，丝切蛋白水平分别为1.43±0.16vs0.74±0.22。采用独立样本t检验分析结果显示，与溶剂对照组相比，美金刚组突触素与丝切蛋白水平显著升高(P＜0.05)；与假手术组相比，CCH组突触素与丝切蛋白水平显著下降(P＜0.05,P＜0.01)。　　3.美金刚对实验动物海马CA1区突触素和棒状结构水平的影响：CCH模型大鼠海马CA1区突触素荧光强度明显下降，棒状结构数量明显增加；而美金刚干预后海马CA1区突触素荧光强度明显增加，棒状结构数量明显减少。各组实验大鼠海马CA1区均有棒状结构形成，但存在数量差异。与溶剂对照组相比，美金刚组突触素平均荧光强度显著增高111.81±14vs63.96±9.86(P＜0.01)，棒状结构数量明显下降1.5±1.29vs7.4±2.88(P＜0.01)；与假手术组相比，CCH组突触素平均荧光强度明显下降56.87±22.44vs126.4±25.21(P＜0.01)，棒状结构数量明显增加6.75±2.22vs0.67±1.15(P＜0.01)。　　4.美金刚对实验动物海马突触超微结构的影响：各组大鼠海马CA1区突触超微结构具有差异。溶剂对照组和CCH组突触结构完整性被破坏，突触后致密物密度降低，突触前后间隙增宽，突触数量减少。而美金刚组大鼠突触结构完整性改善，突触后致密物增多，突触间隙未增宽，突触数量增加。　　结论：　　CCH导致大鼠持续性空间学习记忆和工作记忆功能受损和明显的焦虑样行为改变，美金刚可改善CCH大鼠的行为学表现，显著减少海马结构CA1区棒状结构形成、提高突触素水平，明显改善突触结构完整性。同时，实验动物海马棒状结构形成或可成为CCH相关认知功能受损的重要病理标志，而通过调节棒状结构形成改善认知障碍或可成为血管性认知障碍的干预新靶点。

目录

声明

第1 章 绪论

1.1 研究背景与意义

1.2.1 痴呆与VCI现状

1.2.2 CCH模型在VCI机制研究中的作用

1.2.3 棒状结构在疾病中的作用

1.2.4 cofilin对细胞骨架actin的调节作用

1.2.5 cofilin的上游调控机制

1.2.6 棒状结构的形成机制

1.2.7 棒状结构的形成与突触损伤

1.2.8 NMDA受体简介

1.2.9 美金刚在痴呆中的治疗作用

1.3 研究目的与研究内容

1.4 课题来源

第2 章 美金刚治疗CCH大鼠认知损伤的疗效研究

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验药物与试剂

2.1.3 实验仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 制备CCH大鼠模型

2.2.2 实验分组和给药

2.2.3 旷场实验

2.2.4 Morris 水迷宫实验

2.2.5 数据统计和分析

2.3.1 旷场实验

2.3.2 Morris 水迷宫实验结果

2.4 讨论与小结

第3 章 美金刚治疗CCH大鼠认知损伤的机制探索

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验药物与试剂

3.1.3 实验仪器与设备

3.2.1 制备CCH大鼠模型

3.2.2 实验分组和给药

3.2.3 动物组织标本取材、固定及蛋白提取

3.2.4 蛋白免疫印迹实验

3.2.5 免疫荧光实验

3.2.6 透射电镜实验

3.2.7 数据统计和分析

3.3 实验结果

3.3.1 蛋白免疫印迹实验

3.3.2 免疫荧光实验

3.3.3 透射电镜实验

3.4 讨论与小结

第4 章 全文讨论

结 论

致谢

参考文献

附录 缩略词表

攻读硕士学位期间发表论文