基于订书肽修饰的多功能载药胶束协同杀伤肿瘤细胞

摘要

订书肽是一种包含于生物制剂和小分子试剂的化学制剂，可以在改善多肽稳定性和膜渗透性等药理学性质的同时解决高亲和性的蛋白质间相互拮抗作用。本研究中使用的两亲性模型多肽KLA([KLAKLAK]2)本是一种被设计用于抗菌的多肽，可以通过破坏细菌细胞膜而达到抑菌效果，但在部分研究中发现了其在进入真核细胞内能够靶向线粒体并破坏线粒体膜，导致线粒体内含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的泄漏，进而有效的促进肿瘤细胞的凋亡，具有应用于治疗癌症的潜力。但是抗菌肽KLA的细胞穿透性差，难以跨越细胞膜进入肿瘤细胞内部，同时还存在线性多肽稳定性差的通病，这也导致了多肽的生物利用度低。仅仅使用增加给药量的方法，在增加治疗风险的同时未必能对治疗效果产生明显提升。本研究中，选用一种在之前研究中已经筛选出的订书肽sKLL作为线粒体靶向及破坏药物。通过将线性抗菌肽KLA中的丙氨酸(Ala)突变为亮氨酸(Leu)，可以有效的提高多肽的细胞穿透能力，使多肽能够跨越细胞屏障发挥功能。使用侧链酰胺键订合的方法，在降低突变后线性多肽KLL的溶血性的同时，提高其酶解稳定性。　　另一方面，将订书肽sKLL接枝到两亲性聚合物PPhe-PEG中亲水端PEG的末端，构建成表面接枝订书肽sKLL的胶束，可以通过EPR效应实现肿瘤组织的富集与滞留，再引入2,3-二甲基马来酰亚胺(DA)对订书肽sKLL上赖氨酸(Lys)的胺基进行封闭，使载药胶束表面呈现负电势，延长其体内循环周期。利用DA的pH敏感特性，使胶束可以在肿瘤组织微酸性微环境下表面电荷反转为正，在被动靶向的基础上实现刺激响应靶向，进一步增强胶束的肿瘤组织特异性富集和滞留。在构建PPhe-PEG-sKLL-DA两亲性胶束后，可进一步发挥胶束的优势。在疏水端接枝光热剂克酮酸菁染料(CroconaineDye)，并利用胶束包载疏水性化疗药物阿霉素(DOX)，构建一个结合化疗与光热治疗的高集成的多功能载药胶束。在材料的表征中，证明了载药胶束较高的DOX载药量和载药效率；克酮酸菁染料优良的光热转化效率和光热稳定性可以支撑载药胶束升温至足够的温度并多次循环光热治疗，同时可以在光热升温时促进DOX的释放。　　在基于订书肽sKLL构建的多功能载药胶束的体外表征中，展现了订书肽sKLL分别高于线性抗菌肽KLA和细胞穿透肽TAT两种多肽15.75倍和1.71倍的细胞穿透能力。接枝了订书肽sKLL的pH响应载药胶束在pH6.5微酸性环境下呈现出成倍增长的细胞摄取，同时在保持对正常细胞低毒性的情况下，对肿瘤细胞的细胞毒性超过裸药阿霉素。

目录

声明

第1 章 绪论

1.1 前言

1.2多肽修饰纳米载体

1.2.1 主动靶向肽

1.2.2 细胞穿透肽

1.2.3 促凋亡肽

1.2.4 自组装肽

1.2.5 酶响应肽

1.3 新型订书肽

1.3.1 订书肽的订合方法

1.3.2 订合位点

1.3.3 订合组分

1.3.4 订书肽 sKLL

1.4 肿瘤光热治疗

1.4.1 光热转换剂的分类

1.4.2 克酮酸菁染料

1.4.3 光热与化疗的协同作用

1.5 课题提出与研究内容

1.6 技术路线

1.7 课题创新点

第2 章多功能订书肽sKLL 的构建

2.1 前言

2.2 实验材料和仪器

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

2.2.3 实验细胞

2.3 多肽的合成

2.3.1 多肽 FITC-βA-KLA的合成

2.3.2 多肽 FITC-βA-sKLL的合成

2.3.3 多肽 FITC-βA-TAT的合成

2.4 多肽的表征

2.4.1 多肽纯度及结构

2.4.2 圆二色谱

2.4.3 多肽稳定性分析

2.4.4 多肽的细胞摄取

2.5 结果与讨论

2.5.1 多肽纯度及结构

2.5.2 圆二色谱（CD）

2.5.3 多肽稳定性分析

2.5.4 多肽的细胞摄取

2.6 本章小结

第3 章订书肽sKLL 修饰的载药胶束的构建及表征

3.1 前言

3.2 实验材料和仪器

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.3 订书肽接枝聚合物胶束合成

3.3.1 多肽 Cys-βA-sKLL的合成

3.3.2 克酮酸菁染料（Croconaine Dyes）的合成

3.3.3 光热聚合物胶束的合成

3.3.4 订书肽修饰的 pH响应性光热胶束的合成

3.4 材料的表征

3.4.1 多肽纯度及结构

3.4.2 聚合物胶束结构

3.5 结果与讨论

3.5.1 多肽纯度及结构

3.5.2 材料结构

3.5.3 聚合物胶束 Size/Zeta及形貌

3.5.4 聚合物胶束 UV-Vis吸收光谱

3.5.5 聚合物胶束载药及释放

3.5.6 聚合物胶束 pH响应

3.5.7 聚合物胶束光热性质

3.6 本章小结

第4 章订书肽sKLL 修饰的载药胶束协同杀伤肿瘤细胞研究

4.1 前言

4.2 实验材料和仪器

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验仪器

4.2.3 实验细胞

4.3 体外生物学表征

4.3.1 生物相容性

4.3.2 细胞摄取

4.3.3 线粒体共定位

4.3.4 线粒体膜电位扰乱

4.3.5 肿瘤细胞杀伤效果

4.4 结果与讨论

4.4.1 生物相容性

4.4.2 细胞摄取

4.4.3 线粒体共定位

4.4.4 线粒体膜电位扰乱

4.4.5 肿瘤细胞杀伤效果

4.5 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表论文情况