囊泡运输相关蛋白VAMP7，EMC3和SH3PX1在果蝇发育过程中的作用

摘要

果蝇是一种研究发育生物学的重要模式生物，通过对参与细胞囊泡运输蛋白进行RNA干扰筛选实验，我们发现VAMP7和EMC3对形态发生因子Wingless(Wg)的运输和信号转导有调节作用，同时我们还发现SH3PX1在果蝇精子发生过程中的个体化过程早期起作用。VAMP7是一种SNARE蛋白，SNARE蛋白家族在细胞内囊泡运输中调节囊泡融合。我们观察到在果蝇翅膀成虫盘发育过程中，VAMP7可以调节含有Wg的囊泡运输通路。当VAMP7缺失时，Wg增多并积累在Rab4标记的快速循环内体中，而Wg在其他囊泡中的含量并未发生显著变化，这表明VAMP7突变后，囊泡中Wg的增加并不是一种随机任意的变化，而有可能和Wg的囊泡运输过程相关联。我们还观察到与Wg发生相互作用，调节Wg运输的膜蛋白Dally-like(Dlp)的分布也出现变化:在果蝇翅膀成虫盘上皮细胞的顶部区域Dlp增多，并且和Wg一样Dlp也集中于Rab4标记的循环内体中。Dlp除了参与Wg运输以外，过量的Dlp会抑制Wg的信号的下游靶基因senseless（sens）表达，Dlp是Wg的一种负反馈调节分子，Dlp的双重功能限制sens只表达在Wg分泌细胞旁。以往的研究发现无论是Dlp蛋白量变化还是运输方式变化都会引起Wg信号下游Sens表达的变化。在我们的研究中，当VAMP7缺少时，Sens减弱。此外，我们也对参与Wg运输的其他膜蛋白膜蛋白和其他形态发生因子进行了检查，发现除磷脂酰肌醇锚钉蛋白外，其他分子无显著变化，这说明VAMP7对磷脂酰肌醇锚钉蛋白运输有一定的特异性。综上所述，我们推测VAMP7可能参与调节Wg和Dlp的运输，两VAMP7的缺失导致Wg和Dlp在Rab4依赖的循环内体中聚集，这种运输通路的改变可能影响到Wg浓度梯度的形成，并且影响到Wg的信号传导。此外，我们还发现了位于内质网的蛋白Reticulum Membrane Complex3(EMC3)突变时，Wg会积累在分泌细胞的内质网中，但是与VAMP7突变时情况不同，其他多种类型的蛋白也出现积累，说明EMC3在运输通路中的作用不如VAMP7特异。在RNA筛选实验中，我们还观察到SH3PX1缺失的果蝇雄性不育，而在进一步的研究中，通过对果蝇精子发生各阶段的分析，我们发现SH3PX1突变果蝇个体化过程无法完成，精子个体化早期一些细胞器移动不同步，我们推测SH3PX1可能参与个体化早期囊泡移动。以往的研究多集中于基因表达层面对发育过程的调节，近年来蛋白运输在发育过程中的调节作用越来越受重视，而我们的发现三个与囊泡运输相关的蛋白参与调节果蝇发育过程，我们的研究为信号分子如何通过改变空间位置调控细胞进一步分化提出一种可能的模式。

目录

声明

摘要

第1章 简介

1．1 形态发生因子

1．1．1 形态发生因子在发育过程中的作用

1．1．2 形态发生因子在果蝇发育过程中的研究

1．1．3 形态发生因子在果蝇成虫盘发育过程中的研究

1．1．4 果蝇翅膀成虫盘中研究形态发生因子的方法

1．1．5 影响果蝇翅膀成虫盘发育的三种形态发生因子

1．1．6 在果蝇翅膀成虫盘中研究形态发生因子的意义

1．2 细胞内囊泡运输

1．2．1 囊泡结构

1．2．2 囊泡运输过程

1．2．3 细胞胞吞作用

1．2．4 Rab蛋白

1．2．5 SNARE蛋白

1．2．6 VAMP7蛋白

1．2．7 EMC3蛋白

1．2．8 SH3PX1蛋白

2．1．1 P转座因子

2．1．2 Flp／FRT重组

2．1．3 RNAi技术

2．2 实验所用材料

2．2．1 果蝇菌株

2．2．2 抗体免疫荧光标记

2．3 实验所用方法

2．3．1 RNAi转基因果蝇

2．2．2 突变克隆产生

2．2．3 荧光染色实验步骤

2．2．4 数据统计

第3章 实验结果

3．1．1 VAMP7参与Wg的运输

3．1．2 Wg下游信号受VAMP7突变影响

3．1．3 DlP在VAMP7突变细胞增多

3．1．4 DlP和Wg在Rab4标记的快速循环内体中接触

3．1．5 VAMP7对蛋白的运输有一定的选择性

3．2 EMC3缺失造成多种蛋白积累

3．2．1 EMC3缺失造成Wg积累在内质网中

3．2．2 EMC3突变影响Wg信号

3．2．3 EMC3突变造成多种蛋白积累

3．3 SH3PX1突变的果蝇雄性不育

3．3．1 SH3PX1突变体个体化过程无法完成

3．3．2 SH3PX1突变细胞的高尔基体移动不同步

第4章 讨论

4．2 内吞运输对Wg信号的作用

4．3 DlP对Wg信号的影响

4．4 EMC3和SH3PX1的功能需要进一步研究

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果