基于在微米管表面的CHA放大方法用于miRNA-21的灵敏性检测

摘要

微小RNA(miRNA)是一类典型的、小的、由内源基因编码的单链RNA分子（大约含有22个碱基），它们在动植物中参与转录后基因的表达与调控，在生命体中具有十分重要的意义。经研究发现，miRNA的异常表达与疾病的发生和发展有关，它们已成为人类早期癌症诊断和疾病预防的新型标志物。发展在复杂的生物环境中，高效、快速地检测微小RNA，成为近年来科学家们的研究热点。
　　荧光的检测手段具有响应性高、易操作等优点，被广泛应用于生化分子（如:DNA、酶）的检测。然而，传统的荧光分子在生物体系中存在稳定性差、易被体系中荧光蛋白干扰等缺点，限制了它的实际应用。为解决这一问题，我们之前开发了一种聚二乙炔微米管光波导检测平台，用于微小RNA的响应性检测。它的一维波导结构，能够有效避免生命体系中自体荧光的干扰。考虑到Au@PDA微米管很难在缓冲液中长期储存，我们将三明治杂交设计与微米管体系相结合。在该策略中，三明治结构的形成简化了反应及制备过程，提高反应效率，提高检测器的回收利用能力及稳定性，为制备早期疾病筛查设备带来了意义与价值。
　　为了在复杂环境中实现目标分子的痕量检测，科学家们建立了许多信号放大策略，如催化Hairpin探针自组装反应(CHA)。然而，在CHA回路反应中，两个发夹探针在不存在目标分子时也能够潜在的发生非特异性结合反应，产生较强的背景信号，妨碍了CHA设计对于痕量miRNA的分析与应用。为解决这一问题，我们将微米管波导体系与CHA回路反应相结合，设计了异相CHA反应。并且证实了在微米管表面的链反应性能提高，同时背景信号降低。值得注意的是，该微米管检测平台在分析实体样本时表现出优异的性能，可用于区分癌症的血清样本与健康人的血清样本中微小RNA的表达水平。这项工作不仅对实际复杂生物环境中的miRNA检测提供了应用基础，并且也为制备便携式医疗检测设备提供了可能。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 检测方法

1．2．2 诺瑟印迹杂交(Northern blotting)

1．2．3 miRNA微阵列技术

1．2．4 电化学方法

1．2．5 比色法

1．2．7 荧光法

1．3 放大方法

1．3．1 浓缩富集法

1．3．2 表面增强拉曼散射(SERS)

1．3．3 超级三明治结构

1．3．4 滚环扩增反应(RCA)

1．3．5 催化Hairpin探针自主装反应

1．3．6 酶辅助的信号放大方法

1．3．7 多种放大方法结合的联级反应

1．4 本论文的研究目的与内容

参考文献

第二章 构筑微米管-DNA-金纳米棒的三明治体系对miRNA-215的响应性检测

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．2 组装氨基双炔微米管

2．2．3 合成probel修饰的PDA微米管

2．2．4 合成金纳米棒

2．2．5 制备probe2修饰的金纳米棒

2．2．6 在缓冲液、血清、组织提取液中检测目标miRNA-215

2．3 结果与讨论

2．3．1 构筑双键修饰的聚二乙炔微米管

2．3．2 构筑probe 1修饰的聚二乙炔微米管

2．3．3 构筑probe 2修饰的金纳米棒

2．3．4 基于聚二乙炔微米管三明治体系对miRNA-215的检测机理

2．3．5 金纳米棒的最佳浓度

2．3．6 浓缩富集过程

2．3．7 基于浓缩富集效应的三明治杂交反应动力学

2．3．8 与在200μL缓冲液中反应做对比

2．3．9 用浓缩富集的方法检测miRNA-215

2．3．10 微米管检测平台的重复性

2．3．11 与其他工作进行比较

2．3．12 微米管检测平台的专一性和选择性

2．3．13 微米管检测平台的可循环性

2．3．14 微米管检测平台的稳定性

2．3．15 在复杂环境中微米管检测平台的抗干扰能力

2．3．16 在临床样本中检测miRNA-215

2．4 本章小结

参考文献

第三章 构筑异相CHA／微米管波导体系对miRNA-21的灵敏性检测

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 原料和试剂

3．2．2 构筑微米管波导体系

3．3．1 Au@PDA微米管结合CHA放大反应的检测机理

3．3．2 异相CHA微米管体系与均相CHA体系作对比

3．3．3 Au@PDA微米管检测平台对miRNA-21的响应性检测

3．3．4 AU@PDA微米管检测平台的专一性和选择性

3．3．5 在血清环境中检测miRNA-21

3．3．6 在癌症病人的血清样本中检测miRNA-21

3．4 本章小结

参考文献

4．1 总结

4．2 展望

致谢

在读期间发表的学术论文及取得的研究成果