大肠杆菌转乙酰酶ElaA的结构和功能研究

摘要

乙酰化是一种广泛存在于真核及原核生物细胞内的蛋白质翻译后修饰现象，在乙酰基转移酶的催化作用下，酰基供体（如乙酰CoA等小分子化合物）可将乙酰基转移至底物蛋白的相关氨基酸残基上。目前对乙酰基转移酶类的相关研究发现主要集中于真核生物，在原核生物中的研究较少。ElaA蛋白广泛分布于多种细菌中，在不同菌种中具有较高的同源性。它们被认为是一类乙酰基转移酶，然而对这种功能的定义以及特异性底物还缺乏深入的研究。本研究以来源于大肠杆菌K-12菌株中的ElaA(EcElaA)为对象，开展它的三维结构和功能关系的研究。 我们通过对EcElaA进行了大规模表达和纯化，将纯化的蛋白进行结晶筛选，获得了符合X射线衍射质量的晶体。通过收集衍射数据，我们解析了分辨率为2.60(A)的晶体结构。结构表明EcElaA具有GCN5-related N-acetyltransferase(GNAT)家族典型的结构特征，由7个反平行β折叠片及4个α-螺旋组成。通过结构比对，发现来自于金黄色葡萄球菌中的GNAT家族另一成员SACOL1063-AcCoA复合物三维构象与其高度相似，结构叠加比较，推断EcElaA中具有与其相似的乙酰CoA结合位点及受体底物结合位点。 经超速离心分析，得知EcElaA在溶液中主要以二聚体形式存在，等温滴定量热(ITC)实验结果表明小分子乙酰CoA与EcElaA有明显的相互作用。随后我们对EcElaA-AcCoA复合物进行了晶体筛选，经过大量的结晶优化，仍未能获得X射线衍射质量的晶体。 EcElaA-AcCoA复合物晶体及探索EcElaA与可能的底物的相互作用为其他原核生物中乙酰基转移酶的结构解析指明了方向，也为深入研究原核生物中这一类乙酰基转移酶在细胞内的作用机理及相应的生物学功能奠定了基础。

目录

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摘要

第1章绪论

1．1真核生物蛋白质乙酰化修饰

1．2组蛋白乙酰基转移酶

1．2．1 GCN5的空间结构解析

1．2．2人PCAF结构简介

1．2．3 GCN5／PCAF与疾病的相关性

1．3 原核生物乙酰化修饰

1．3．1原核生物乙酰化修饰发现历程

1．3．2原核生物乙酰基转移酶类型

1．3．3原核生物重要蛋白质乙酰化修饰举例

1．3．4原核乙酰基转移酶结构举例

1．4研究意义

第2章大肠杆菌表达ElaA蛋白的实验材料及流程

2．1实验材料及仪器

2．1．1实验材料

2．1．2实验仪器

2．2实验流程

2．2．1构建表达载体

2．2．2 ElaA蛋白的表达及纯化

2．3 ElaA蛋白和辅因子乙酰CoA的共结晶

2．3．1等温滴定量热相关原理

2．3．2 ElaA蛋白和辅因子乙酰CoA的等温滴定实验

2．3．3 ElaA蛋白和辅因子乙酰CoA的共结晶

第3章实验结果与讨论

3．2 Superdex 200 prep grade分子筛峰图

3．3超速离心分析(AUC)测定ElaA蛋白质聚合状态结果

3．4 ITC测定ElaA与其配体乙酰CoA结合情况分析

3．5 ElaA结晶

3．6 ElaA衍射数据

3．6．1结晶条件及相关实验方法

3．6．2 ElaA晶体衍射花样

3．6．3衍射数据收集及处理

3．6．4结构解析及模型修正

3．6．5拉式常数图

3．7 ElaA晶体结构

3．7．1 apo-ElaA晶体结构

3．7．2 EcElaA同源蛋白序列比对

3．8 EcElaA与GNAT大家族相关乙酰基转移酶的结构比对

3．8．1 SACOL1063与EcElaA的结构比对

3．8．2血清素N-乙酰基转移酶与EcElaA的结构比对

3．9 ElaA功能突变实验

4．0 ElaA与CoA复合物结构

第4章结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及成果