冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体并缓解相关疾病的作用及机制探究

摘要

NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC以及pro-caspase-1组成的多聚蛋白复合物。活化的NLRP3炎症小体可以促进caspase-1的活化，介导IL-1β以及IL-18的成熟和分泌，进而促进炎症反应。NLRP3炎症小体不仅能识别外源病原相关分子模式(PAMPs)，如真菌酵母聚糖，而且能够识别内源危险相关分子模式(DAMPs)，如尿酸盐结晶、胆固醇结晶、β淀粉样肽、不饱和脂肪酸以及神经酰胺等。由于NLRP3炎症小体的活化剂多种多样，关于NLRP3炎症小体活化的具体机制还不清楚，目前有三种假说:钾离子外流假说、活性氧产生假说以及溶酶体破碎假说。NLRP3炎症小体活化失调会导致许多疾病发生，如痛风、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和2型糖尿病等。
　　目前发现一些NLRP3炎症小体抑制剂能够对NLRP3炎症小体相关疾病起到一定治疗效果，但是作用方式不够直接，而是通过一些上游信号通路起作用，副作用未知，应用前景不明。而除了通过抑制NLRP3炎症小体相关上游信号抑制炎症小体活化之外，还可以直接靶向NLRP3炎症小体组份进而影响NLRP3炎症小体组装，而ASC和pro-caspase-1不仅在NLRP3炎症小体中起作用，在其他炎症小体活化过程中也起着至关重要的作用。所以特异性靶向NLRP3是抑制NLRP3炎症小体相关疾病的最佳选择。已经有文献报道CY-09可以直接与NLRP3结合，通过抑制NLRP3ATP酶活性进而抑制NLRP3炎症小体的组装，达到治疗NLRP3相关疾病的效果。但由于CY-09是一种人工合成的小分子，其应用前景还需要进一步确定。
　　冬凌草是一种传统中药，广泛用于治疗各种炎症性疾病，近代研究发现其对癌症也有一定治疗效果。冬凌草甲素是冬凌草的主要成分之一，其能够通过诱导细胞凋亡、细胞周期停滞等来行使抗癌的功能。目前已有文献报道，冬凌草甲素能够通过抑制NF-κB、MAPK信号通路来抑制炎性细胞因子如IL-6、TNF-α分泌，并且对一些炎症疾病如结肠炎、败血症以及阿尔兹海默症具有良好的保护作用。虽然已经发现冬凌草甲素具有抗炎功能，但是其作用靶点以及作用机制还不清楚。
　　本研究发现冬凌草甲素能够通过碳碳双键与NLRP3NACHT结构域中279位半胱氨酸共价键结合，影响NLRP3-NEK7相互作用，干扰炎症小体组装，进而抑制炎症小体活化。并且发现对于NLRP3炎症小体相关疾病如腹膜炎、关节炎以及2型糖尿病有良好的治疗效果。本研究阐明了冬凌草甲素的抗炎机制，它能够靶向结合NLRP3以抑制NLRP3炎症小体活化，从而行使抗炎功能，并且对于NLRP3炎症小体相关疾病有良好的治疗效果，可以作为一种治疗相关疾病的候选药物。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 固有免疫与模式识别受体

1．2 NOD样受体

1．2．1 NOD样受体的结构与分类

1．2．2 NOD样受体的功能

1．2．3 NOD样受体与疾病

1．3 炎症小体

1．3．1 NLRP1炎症小体

1．3．2 NLRC4炎症小体

1．3．3 AIM2炎症小体

1．3．4 Pyrin炎症小体

1．3．5 NLRP3炎症小体

1．4 NLRP3炎症小体

1．4．1 NLRP3炎症小体的结构与组装

1．4．2 NLRP3炎症小体的活化与调控

1．4．3 NLRP3炎症小体相关的疾病

1．4．4 NLRP3炎症小体抑制剂

1．5 冬凌草与冬凌草甲素

1．5．1 冬凌草甲素与癌症

1．5．2 冬凌草甲素与炎症

第2章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验小鼠

2．1．2 细胞系

2．1．3 质粒

2．1．4 质粒构建用引物

2．1．5 实验用抗体

2．1．6 实验试剂

2．1．7 实验耗材

2．1．8 实验仪器

2．2 实验相关试剂的配制

2．2．1 WB(Western Blotting)相关缓冲液

2．2．2 PBS缓冲液

2．2．3 转染试剂PEI的配制

2．2．4 细菌培养相关培养基的配制

2．3 实验方法

2．3．1 细胞冻存

2．3．2 细胞复苏

2．3．3 细胞培养

2．3．5 小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)的分离与培养

2．3．6 人外周单核细胞(PBMCs)的分离

2．3．7 炎症小体刺激

2．3．8 免疫共沉淀(IP)

2．3．9 Pull down实验(PD)

2．3．10 Bio-Ori结合蛋白检测

2．3．11 质粒构建

2．3．12 质粒抽提

2．3．13 蛋白纯化

2．3．14 MST实验

2．3．15 蛋白质免疫印迹(WB)

2．3．16 酶联免疫吸附反应(ELISA)

2．3．17 线粒体以及线粒体活性氧染色

2．3．18 ASC聚合实验

2．3．19 钾离子检测

2．3．20 氯离子检测

2．3．21 ATP酶活性检测

2．3．22 NLRP3回补实验

2．3．23 MSU诱导的小鼠腹膜炎

2．3．24 MSU诱导的小鼠关节炎

2．3．25 高脂食物诱导的肥胖模型建立与冬凌草甲素治疗

2．3．26 葡萄糖耐量试验

2．3．27 胰岛素耐量试验

2．3．28 统计学显著性分析

第3章 实验结果

3．1 引言

3．2 实验结果

3．2．1 Ori特异性抑制NLRP3炎症小体活化

3．2．2 Ori影响NLRP3炎症小体的组装

3．2．3 Ori直接与NLRP3结合

3．2．4 Ori通过碳碳双键与NLRP3的279位半胱氨酸共价键结合

3．2．5 Ori在体内抑制NLRP3依赖的炎症

3．3 小结与讨论

参考文献

致谢

攻读博士期间的主要研究成果