实验猪CIITA基因特征分析及PRRSV感染后调控SLA Ⅱ类分子表达的机制研究

目录

声明

摘要

1前言

1．1SLA的研究进展

1．1．1SLA的概述

1．1．3SLA Ⅱ类基因的启动子

1．3CIITA对MHC-Ⅱ类分子的反式激活作用

1．4CIITA调节免疫应答的作用机制

1．5CIITA的亚细胞定位

1．6实验动物

1．6．1SPF猪的现状及发展

1．6．2SLA在SPF猪在疾病及生物医学中的重要性

1．7本研究的实验目的及意义

2材料

2．1细胞、毒株、实验动物

2．2生化试剂

2．3主要仪器设备

3方法

3．1CIITA基因的扩增

3．1．1引物的设计与合成

3．1．2总RNA的提取

3．1．3cDNA的合成

3．1．4PCR扩增

3．2CIITA基因剪接突变体的鉴定及特征分析

3．3CIITA剪接突变体在不同组织中的表达模式的检测

3．3．1qRT-PCR引物的设计与合成

3．3．2总RNA的提取

3．3．3cDNA的合成

3．3．4qRT-PCR

3．4．1SLA Ⅱ类功能基因启动子区域的扩增

3．4．2重组质粒的构建及转染

3．4．3双荧光素酶活性检测

3．5CIITA剪切突变体的亚细胞定位分析

3．5．1外源性CIITA剪切突变体的亚细胞定位

3．5．2内源性CIITA剪切突变体的亚细胞定位

3．6．1猪肺泡巨噬细胞的获取

3．6．2qRT-PCR引物的设计与合成

3．6．3总RNA的提取

3．6．4cDNA的合成

3．6．5qRT-PCR

3．7．1qRT-PCR引物的设计与合成

3．7．2重组CIITA慢病毒的构建

3．7．3过表达CIITA后SLA Ⅱ类分子表达变化的检测

3．7．4敲低CIITA表达的siRNA的设计与筛选

3．7．5敲低CIITA表达后SLA Ⅱ类分子表达变化的检测

3．9PRRSV感染后IFN-γ表达与CIITA表达的相关性分析

4结果与分析

4．1CIITA基因的扩增结果

4．2SPF猪CIITA基因剪接突变体的鉴定及特征分析

4．2．1CIITA基因序列的物种间的保守性结果

4．2．2不同猪品种CIITA不同剪接突变体的遗传进化树分析

4．2．3CIITA基因蛋白质二级结构与三级结构预测

4．3CIITA基因剪接突变体在猪不同组织中的表达分析

4．4CIITA剪切突变体对SLA Ⅱ类基因启动子激活鉴定

4．4．1启动子重组质粒构建结果

4．4．2双荧光素酶活性检测结果

4．5CIITA剪切突变体的亚细胞定位分析

4．5．1CIITA剪切突变体亚细胞定位的预测

4．5．2外源性CIITA剪切突变体的亚细胞定位结果

4．5．3内源性CIITA剪切突变体的亚细胞定位结果

4．6PRRSV感染PAMs细胞后CIITA的表达变化分析

4．7．2过表达CIITA后SLA Ⅱ类分子表达变化的检测结果

4．7．3敲低CIITA表达的siRNA的设计与筛选结果

4．8PRRSV感染后CIITA的表达与SLA Ⅱ类分子表达的相关性分析结果

4．9PRRSV感染后IFN-γ表达与CIITA表达的相关性分析结果

5讨论

5．1CIITA剪切突变体的功能影响

5．2CIITA在免疫应答中起到的作用

5．3CIITA的应用与展望

6结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文