催化非共轭烯烃不对称环氧化的单加氧酶筛选及其性质研究

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摘要

1文献综述

1．1．手性及生物催化

1．2手性环氧化合物及其合成方法

1．3动力学拆分外消旋体

1．3．1化学催化动力学拆分制备光学纯的环氧化物

1．3．2生物催化动力学拆分制备光学纯的环氧化物

1．4烯烃不对称环氧化

1．4．1化学催化烯烃不对称环氧化反应

1．4．2生物催化烯烃不对称环氧化反应

1．4．3苯乙烯单加氧酶催化非共轭烯烃不对称环氧化反应

2引言

3材料和方法

3．1质粒和培养基

3．2仪器与试剂

3．2．1主要仪器

3．2．1主要试剂

3．3大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

3．3．1大肠杆菌感受态细胞的制备

3．3．2质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞

3．3催化非共轭烯烃环氧化的苯乙烯单加氧酶的筛选

3．3．1苯乙烯单加氧酶祖先蛋白的构建

3．3．2苯乙烯单加氧酶功能基序的分析

3．3．3候选蛋白的选取

3．3．4候选序列的合成

3．4酶的异源表达

3．5生物催化一般过程及分析方法

3．5．1生物催化非共轭烯烃环氧化反应一般过程

3．5．2HPLC分析一般方法

3．5．2GC分析一般方法

3．6．3反应过程中pH对HhMO催化烯烃环氧化反应的影响

3．7生物催化非共轭烯烃类反应过程及产物解析

3．7．1化学催化烯丙基二级醇类化合物的化学合成

3．7．2化学催化烯丙基二级醇环氧化合物外消旋体的合成

3．7．3生物催化烯丙基苯类化合物反应过程及相关数据

3．7．4生物催化烯丙基二级醇类反应过程及相关数据

3．8生物催化共轭烯烃类反应过程及产物解析

3．8．1化学催化苯乙烯类化合物合成及相关数据

3．8．2化学催化共轭烯烃环氧化合物外消旋体的合成

3．8．3生物催化共轭烯烃类反应过程及相关数据

3．9 HhMO动力学参数的测定

3．9．2 PsStyB蛋白纯化

3．9．4 HhMO催化烯烃环氧化动力学参数的测定

3．10HhMO突变体的构建

4结果与分析

4．1催化非共轭烯烃环氧化酶的筛选

4．1．1苯乙烯单加氧酶祖先蛋白构建及活性分析

4．1．2苯乙烯单加氧酶功能基序分析

4．1．3候选序列的筛选及活性分析

4．2协坳催化烯烃环氧化反应条件的优化

4．2．2辅溶剂对HhMO催化烯烃环氧化反应的影响

4．2．3反应体系pH对HhMO催化烯烃环氧化反应的影响

4．3 HhMO催化烯丙基苯类环氧化底物特异性研究

4．4 HhMO催化烯丙基二级醇动力学拆分

4．5 HhMO催化烯丙基二级酵类环氧化底物特异性研究

4．6 HhMO催化苯乙烯类环氧化底物特异性研究

4．7 HhMO催化烯烃环氧化反应的动力学特征

4．7．2 HhMO催化烯丙基二级醇环氧化动力学参数的测定

4．7．3 HhMO催化苯乙烯环氧化动力学参数的测定

4．8 HhMO中与催化反应的立体选择性相关的位点

5结论与讨论

5．1结论

5．2讨论

参考文献

附录